[发明专利]一种高产L-苏氨酸的重组大肠杆菌及其构建方法

权利要求书

1.一种产L-苏氨酸的重组大肠杆菌，其特征在于，替换了高丝氨酸激酶编码基因thrB启动子为T7启动子，敲除了苏氨酸脱氢酶编码基因tdcB并替换了赖氨酸合成途径二氢吡啶二羧酸合成酶DHDPS编码基因dapA的起始密码子ATG为GTG。

2.如权利要求1所述的重组大肠杆菌，其特征在于，是对大肠杆菌CICC20905进行基因组编辑得到的。

3.如权利要求2所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述基因组编辑是利用CRISPR-Cas9技术进行的。

4.权利要求1-3任一所述的重组大肠杆菌的构建方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

1）构建T7启动子替换重组片段、苏氨酸脱氢酶敲除片段以及二氢吡啶二羧酸合成酶起始密码子替换重组片段：将大肠杆菌高丝氨酸激酶编码基因thrB起始密码子上下游同源臂序列融合后，引入T7启动子，得到重组片段T71；将苏氨酸脱氢酶编码基因tdcB上下游同源臂序列融合后，得到片段TD2；将二氢吡啶二羧酸合成酶DHDPS编码基因dapA的起始密码子上下游同源臂序列进行融合后，将起始密码子ATG替换为GTG，得到片段DA3；

2）构建重组质粒：分别将片段T71、TD2、DA3与含sgRNA的线性化载体连接；分别得到含T71的重组质粒、含TD2的重组质粒和含DA3的重组质粒；

3）构建高产L-苏氨酸重组大肠杆菌：将含有cas9蛋白的质粒转化大肠杆菌CICC20905，得到重组大肠杆菌CICC20905-cas9；随后将含T71的重组质粒转化大肠杆菌CICC20905-cas9，得到重组大肠杆菌CICC20905-thrT；将含TD2的重组质粒转化大肠杆菌CICC20905-thrT，得到重组大肠杆菌CICC20905-tdcD；将含DA3的重组质粒转化大肠杆菌CICC20905-tdcD，确认dapA基因起始密码子被替换为GTG并去除重组质粒pTDA后得到thrB基因簇启动子为T7、tdcB基因缺失且dapA基因起始密码子为GTG的重组大肠杆菌CICC20905-dapG；去除外源质粒后，得到重组大肠杆菌CICC20905-THR。

5.如权利要求4所述的构建方法，其特征在于，所述含有cas9蛋白的质粒包括pCas9。

6.如权利要求4或5所述的构建方法，其特征在于，所述含T71的重组质粒序列如SEQ IDNO.5所示，所述含TD2的重组质粒序列如SEQ ID NO.6所示，所述含DA3的重组质粒SEQ IDNO.7所示。

7.权利要求1-3任一所述的重组大肠杆菌在生产L-苏氨酸中的应用。

8.一种生产L-苏氨酸的方法，其特征在于，将权利要求1-3任一所述的重组大肠杆菌于35-38 ℃、220 rpm条件下培养5-8 h，10-20 %的接种量接种发酵培养基，35-38 ℃、200-220 rpm条件下培养10-14 h，0.05-0.1mM IPTG诱导45-50 h。

9.权利要求1-3任一所述的重组大肠杆菌在饲料、制药、保健品或 食品工业中的应用。