[发明专利]一种脱除甜瓜种子中黄瓜花叶病毒的方法

权利要求书

1.一种脱除甜瓜种子中黄瓜花叶病毒的方法，其特征在于通过以下步骤实现：

（1）干热处理：将甜瓜种子置于电热鼓风干燥箱网架上65℃条件下，热风处理48 h；

（2）药剂处理：待甜瓜种子自然冷却后，加入5倍体积的10%Na₃PO₄溶液，浸泡40 min；

（3）滤种：药剂处理结束后，过滤种子，滤去10% Na₃PO₄溶液；

（4）漂洗：用无菌水清洗甜瓜种子3-5次，滤干无菌水；

（5）烘干：及时将步骤4中得到的种子均匀摊开，置于电热鼓风干燥箱网架上，35 ℃干燥至种子含水量低于10%；

（6）病毒检测：利用实时荧光定量PCR检测方法对步骤5获得的种子进行病毒检测，并根据PCR扩增曲线Ct值和标准曲线方程即可对甜瓜种子中的黄瓜花叶病毒进行精确定量，计算脱毒率；

所述的病毒检测具体步骤如下：

（1）提取甜瓜种子总RNA：随机选取10粒脱毒处理的种子和10粒未脱毒处理的种子，每粒为1份，分别在液氮中研磨至粉末，采用植物总RNA提取试剂盒提取样品总RNA，抽提RNA产物加入DEPC-ddH₂O溶解，-70 ℃保存备用；

（2）cDNA的合成：以提取的待测甜瓜种子总RNA为模板，反转录制备cDNA模板，反转录体系为20µL包括：RNA模板2µL，10mmol/L的dNTPs 2µL，10µmol/L的随机引物2 µL，10×RT mix2µL，Quant Reverse Transcriptase 2µL，RNase-free ddH₂O 10µL，反应条件：37 ℃，60min；

（3）实时荧光定量PCR检测：以合成的cDNA为模板，分别设阳性对照、阴性对照及无菌双蒸水空白对照，利用黄瓜花叶病毒特异性引物对：CMV-CP1：AGTCCGTAAAGTTCCTGC；CMV-CP2：TCATGTCGCCAATATCAG进行实时荧光定量PCR检测；实时荧光定量PCR检测体系为20µL：包括Maxima SYBR Green/ROX qPCR Master Mix (2x) 10µL，10µmol/L的上游引物CMV-CP1 0.4µL、10µmol/L的下游引物CMV-CP2 0.4µL，模板1µL，补足灭菌ddH₂O至20µL；荧光定量PCR检测反应程序为：94℃预变性4 min；94℃变性30 s，60℃退火、延伸30 s，循环40次；60℃收集荧光；

（4）带毒量检测：反应结束后记录检测样品的PCR扩增曲线Ct值，通过建立的黄瓜花叶病毒实时荧光定量PCR反应的标准曲线方程：y=-3.9872x＋54.128，x为所测样品中黄瓜花叶病毒目标基因片段拷贝数的对数，y为Ct值；计算出检测样品中黄瓜花叶病毒的基因片段拷贝浓度，从而对甜瓜种子中黄瓜花叶病毒含量进行定量检测；

（5）计算种子脱毒率：种子脱毒率（%）=（1-处理后种子的带毒量/未处理种子带毒量）×100。