[发明专利]一种载金属离子聚丙烯酰胺磁珠及其制备方法和应用

说明书

本发明涉及一种载金属离子聚丙烯酰胺磁珠及其制备方法和应用，首先利用共沉淀法制得了超顺磁性的纳米四氧化三铁，接着采用过硫酸钾进行改性后在其表面修饰一层聚丙烯酰胺，再通过聚丙烯酰胺中两个相邻的酰胺基团与Cu²⁺、Ni²⁺、Zn²⁺、Fe³⁺等金属离子螯合，最终得到了性能优异的载金属离子聚丙烯酰胺磁珠。该磁珠具有较好的磁性、分散性和稳定性，合成方法简单，反应易于控制，可用于组氨酸标签蛋白的分离、纯化和固定化。

技术领域

本发明涉及生物层析材料技术领域，具体涉及一种载金属离子聚丙烯酰胺磁珠及其制备方法和应用。

背景技术

自1975年Porath首次提出金属螯合亲和层析技术以来，亲和层析在蛋白质纯化领域有着非常广泛的应用。目前，在大多数原核生物表达的重组蛋白质末端都带有六聚组氨酸(也称为组氨酸标签，His-tag)，科研人员利用金属螯合亲和层析分离得到了高纯度的重组蛋白质。

金属螯合亲和层析分离的原理为：利用蛋白质表面的氨基酸与金属离子亲和力的差异实现分离纯化。具体来看，过渡态金属离子能与氮、氧、硫等原子以配位键结合，当金属离子上有剩余的空轨道即可与蛋白质表面亲和力强的氨基酸(如组氨酸、色氨酸、半胱氨酸等)的残基配位，从而使蛋白质结合在载体表面。与传统的亲和配体(如抗原-抗体)相比，金属螯合亲和层析更稳定、更经济，且吸附效率更高，并且磁性金属螯合亲和载体可在磁场作用下亲和分离带组氨酸标签的蛋白质或多肽，操作更加简便，层析材料可重复使用，可以一步实现蛋白质的纯化和固定化。

金属螯合亲和层析材料一般由四部分组成，分别为载体、连接臂、螯合配体、金属离子。理想的载体应当具备不溶于水但高度亲水性、化学惰性以及具有多孔网状结构等性质；常用的螯合配体主要是一些小分子，如氨基三乙酸、亚氨基乙二酸和三(羧甲基)乙二胺等；在螯合配体和载体之间需要一定长度的连接臂。目前常用的金属螯合亲和层析材料主要包括柱填充材料、磁性材料和凝胶材料等。其中，磁性材料具有磁响应性使其容易分离，不仅所需设备简单而且操作简便，能够高效实现目标产物的分离纯化及固定化。磁性亲和载体的制备方法通常有包埋法和原位合成法，包埋法是以四氧化三铁为磁核，在其表面修饰二氧化硅、壳聚糖及其他高分子，再将Cu²⁺、Ni²⁺、Zn²⁺、Fe³⁺等金属离子螯合或固定在其表面即可。

检索发现，现有的金属螯合亲和层析材料普遍存在以下两个问题：一是颗粒较大普遍为微米级(如CN107899552A)，使得材料的比表面积较小，影响了吸附性能；二是制备方法复杂繁琐、周期长、需要层层向外合成，如CN107899552A、CN107754769A、CN107754767A等。在此基础上，本发明通过过硫酸钾改性、聚合包覆、螯合等步骤简单、高效的制得了性能优异的载金属离子聚丙烯酰胺磁珠。该磁珠为纳米级，具有更高的比表面积且表面具有较多配位基团，能高效提取带组氨酸标签的蛋白。

发明内容

本发明的目的在于克服现有金属螯合亲和层析材料及其制备、应用过程中存在的上述问题，提供一种新型载金属离子聚丙烯酰胺磁珠层析材料。该金属螯合亲和层析材料具有合成步骤少、反应可控程度高、每一步及总体产率较高、分离方法简单易行、生产及使用成本较低、分散性稳定性较好等优点，利用其可实现组氨酸标签蛋白的一步或分步纯化及固定化。

本发明的目的之一在于提供一种载金属离子聚丙烯酰胺磁珠的制备方法，包括以下步骤：

(a)采用共沉淀法制备顺磁性纳米四氧化三铁(Fe₃O₄)；

(b)将纳米四氧化三铁加入到过硫酸钾水溶液中，接着将其与丙烯酰胺混合交联体系混合，反应完成后固液分离，洗涤得到聚丙烯酰胺磁珠；

(c)将聚丙烯酰胺磁珠与金属离子溶液混合，洗涤分离得到载金属离子聚丙烯酰胺磁珠。