[发明专利]一种用于检测CYP2D6基因拷贝数变异的试剂盒

说明书

本发明涉及本一种用于检测CYP2D6基因拷贝数变异的试剂盒，包括用于检测CYP2D6基因的第2内含子、第6外显子、第5内含子和内参基因RPP30，使用实时荧光定量技术，快速准确的测定CYP2D6基因的拷贝数变化。使用本发明的试剂盒可在同一个反应条件下同时对3个与CYP2D6相关基因的位点进行高通量检测检测的特异性强，灵敏度高，最低检测限为1ng/μL，用时短，从标本送检到得出结果可在2小时以内完成。

技术领域

本发明涉及CYP2D6基因多态性检测领域，更特别地，涉及一种用于检测CYP2D6基因拷贝数变异的试剂盒。

背景技术

CYP2D6是CYP酶家族重要的成员之一，占肝脏酶总量的2-9％，但是参与20-30％药物的代谢，包括β受体阻滞剂、抗抑郁药、抗心律失常药、抗精神病药(如销售额最大的阿立哌唑)、镇痛药等。CYP2D6是第一个被确认由单基因控制的P450酶。CYP2D6位于第22号染色体上，共含有9个外显子和8个内含子，总长度约为5400bp，是一个完整的功能性基因。研究发现CYP2D6基因存在多态性和基因拷贝数重复等变异。目前已发现超过100种CYP2D6等位基因的变异，主要包括单核苷酸变异、大片段基因的丢失以及拷贝数变异。这些变异使CYP2D6基因呈现多态性，并决定其编码蛋白的酶活性表现为缺失、降低、正常或是增加等几种类型，进一步对药物的代谢同样表现出多样性。

现阶段CYP2D6拷贝数异常检测的主要方法包括二代测序、微阵列芯片、荧光PCR等。这些方法或耗时长，操作复杂，或对操作者和实验场地有较高要求，或检测费用较高，或难以同时检测多个基因的不同突变位点。因此，有必要建立一种高通量、高效率、低成本的基因表达水平检测方法和产品，以实现快速检测及乳腺癌患者的普遍检测。

发明内容

我们在研究中发现，CYP2D6基因的个变异位点中影响中国人CYP2D6功能的常见变异有8个，包括快代谢型基因变异(基因拷贝数增多。包括型等位基因*1、等位基因*2)、中间代谢型基因变异(CYP2D6*9、*10、*14和*41)和慢代谢型基因变异(CYP2D6*3、*4和*5)。CYP2D6基因的这些变异可引起酶活性以及酶数量的差异，导致疗效不足或毒副作用的产生，最终产生药物疗效的个体差异。因此，CYP2D6的多态性研究对临床具有重要的意义，已经成为目前研究的热点。CYP2D6基因的拷贝数变化尤其重要，因为基因重复引起的拷贝数增加和基因缺失引起的拷贝数减少是影响CYP2D6酶活性增高和降低的重要原因。检测CYP2D6基因的单核苷酸多态性、寡核苷酸插入和缺失能够检测CYP2D6酶活性的缺失和降低，但是只有基因拷贝数的增加能够决定CYP2D6酶活性的增加。因此，CYP2D6基因拷贝数检测在临床应用具有重要意义。微流控技术是以微加工技术实现微体积反应，并可实现高通量反应使得手工操作和检测成本大幅降低，显著提高效率。

基于以上研究，本发明提供了一种用于检测CYP2D6基因拷贝数变异的试剂盒，包括用于检测CYP2D6基因的多个区段的PCR扩增引物和荧光探针，以及参比基因的引物和探针。

在一个优选实施方案中，所检测的CYP2D6基因的区段包括CYP2D6基因的第2内含子、第6外显子、第5内含子中的一个或多个。

在一个优选实施方案中，用于检测第2内含子的引物对如SEQ ID NO 1和2所示，探针如SEQ ID NO 3所示。

在一个优选实施方案中，用于检测第6外显子的引物对如SEQ ID NO 4和5所示，探针如SEQ ID NO 6所示。

在一个优选实施方案中，用于检测第5内含子的引物对如SEQ ID NO 7和8所示，探针如SEQ ID NO 9所示。

在一个优选实施方案中，所述参比基因为RPP30基因。

在一个优选实施方案中，用于检测RPP30基因的引物对如SEQ ID NO 10和11所示，探针如SEQ ID NO 12所示。