[发明专利]一株基因组重排高产菌及其在生产天赐霉素中的应用

说明书

本发明公开了一株基因组重排高产菌及其在生产天赐霉素中的应用，所述基因组重排高产菌为Streptomyces sp.CB03234‑GS26，已于2018年7月16日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M 2018485。本发明通过基于已有高产菌株Streptomyces sp.CB03234‑S（保藏编号为CCTCC M 2017538）和庆大霉素抗性核糖体工程突变菌Streptomyces sp.CB03234‑G的基因组重排，获得稳定的新型烯二炔类天然产物天赐霉素‑A（TNM‑A）的高产菌株CB03234‑GS26，其TNM‑A的发酵产率超过38 mg/L。

技术领域

本发明涉及一株基因组重排高产菌及其在生产天赐霉素中的应用，属于生物医药技术领域。

背景技术

烯二炔类天然产物具有独特的共轭炔-烯-炔分子结构和超强生物活性，是最具开发前景的一类抗肿瘤抗生素，根据其核心结构可分为包括新制癌菌素(neocarzinotatin，NCS)、力达霉素(C-1027)、kedarcidin和maduropepti等在内的九元环烯二炔，以及包括卡奇霉素(calicheamicin，CAL)、esperamicin、dynemicin(DYN)和uncialamycin(UCM)等在内的十元环烯二炔。烯二炔类抗肿瘤抗生素的生物活性主要依赖于其诱导的DNA损伤机制，即通过电子重排形成暂时性苯环双自由基，对DNA小沟进行亲核攻击后形成以脱氧核糖核酸碳链为中心的自由基，并在分子氧的作用下引起单链或双链DNA的断裂。作为迄今为止发现的细胞毒性最强的一类分子，烯二炔类天然产物可作为抗肿瘤抗体偶联药物(ADC)的弹头分子，具有极高的成药前景。目前发现的13种烯二炔分子中，NCS和CAL已被开发成为临床药物，其中由日本开发的SMANCS(聚苯乙烯马来酸共轭NCS)主要用于治疗肝癌，而美国辉瑞公司最近开发的ADC药物Mylotarg(CD33单克隆抗体偶联CAL)和Besponsa(CD22单克隆抗体偶联CAL)则分别用于治疗急性骨髓性白血病和成人复发或难治性B细胞前体急性淋性白血病。

天赐霉素-A(Tiancimycin-A，缩略TNM-A)是2016年通过基因组挖掘技术从链霉菌(Streptomyces sp.CB03234，简称CB03234)的发酵产物中分离发现的一种新型十元环烯二炔抗肿瘤抗生素，其结构如下所示：

结构式中右侧的十字交叉处没有碳原子。

天赐霉素-A与UCM和DYN结构类似，对多种恶性肿瘤细胞有超高的活性，超过目前临床一线化疗药物丝裂霉素近千倍，并且表现出更快速和更完整的肿瘤细胞杀伤力，将是抗肿瘤ADC药物理想的弹头药物分子，该成果已发表在国际微生物权威期刊MBio.上(2016；7(6).pii:e02104-16)。TNM-A在原始菌株(Streptomyces sp.CB03234)中的产量极低，仅为0.3mg/L左右，而目前达到工业化制备水平的其它烯二炔类天然产物的产量均在20mg/L以上，因此现有TNM-A的来源远远不能满足临床研究和工业化生产的应用需求。同时TNM-A因其复杂独特的分子结构，无法通过传统的化学合成方法来获取，通过微生物发酵是目前制备TNM-A最切实可行的手段。

基因组重排主要利用原生质体融合对微生物进行全基因组范围的片段重组和交换，经过多轮递推筛选融合子来不断地累积有益的突变，从而实现目标菌种的正向进化，与传统育种方法相比具有许多明显优势。基于核糖体工程对TNM-A原始产生菌株Streptomyces sp.CB03234进行突变，分别获得了具有不同抗生素抗性的突变菌株，其TNM-A的产量均比原始菌株有明显提高。在此基础上，以上述核糖体工程突变菌株为亲本，运用基于原生质体融合的基因组重排，筛选获得TNM-A产量进一步提升的高产菌株，将为实现其规模化生产和制备，推动TNM-A后继的抗癌活性分析、作用机理等临床前期研究，以及相关抗肿瘤ADC新药的开发奠定重要基础。

发明内容