[发明专利]一种鹅催乳素的双抗体夹心ELISA检测方法

说明书

本发明公开一种鹅催乳素的双抗体夹心ELISA检测方法，属于生物技术领域的免疫学检测方法；本发明以抗原亲和纯化的催乳素抗体为捕获抗体，生物素标记的催乳素抗体为检测抗体，鹅催乳素重组蛋白为标准品，建立了一种检测鹅催乳素的双抗体夹心ELISA方法；该方法易于操作，灵敏度高，重复性好，能够准确检测鹅血浆中催乳素浓度的变化，弥补了国内外水禽催乳素检测方法的不足。

技术领域

本发明属于生物技术领域的免疫学检测方法，具体涉及一种鹅催乳素的双抗体夹心ELISA检测方法。

背景技术

催乳素(Prolactin,PRL)是一种主要由动物垂体前叶嗜酸性细胞分泌的蛋白质激素。在哺乳动物中，PRL的主要作用是促进乳腺发育，刺激并维持泌乳。在禽类中，PRL的主要作用是促进和维持就巢，以及感受光周期调节禽类的季节性繁殖。

PRL的定量检测方法包括生物学测定方法和免疫学测定方法。生物学测定方法包括鸽嗉囊促进实验、兔泌乳促进实验和Nb2型淋巴细胞增殖实验等。虽然生物学测定方法能够检测具有生物学活性的PRL含量，但是其检测限高、重复性差、耗时长。免疫测定方法则利用了抗原-抗体反应，其特异性强，灵敏度高。其中，放射免疫法(RIA)的灵敏度比酶联免疫法(ELISA)高，但其缺点也十分明显，如同位素标记有效期短、损害实验人员健康和危害环境等。化学发光和电化学发光法的灵敏度优于RIA法和ELISA法，但其需要的仪器昂贵，且都为针对人PRL开发的封闭系统，限制了它的广泛使用。因此，ELISA法因其灵敏度高，简单快速，重复性较好，避免了RIA法的缺点，受到众多实验室的欢迎。

目前，国内外许多厂商开发了分别适用于人类以及鼠、猪、羊、牛和鸡等动物的PRLELISA试剂盒，但是缺乏适用于水禽如鸭和鹅的PRLELISA试剂盒。虽然鸡和鸭、鹅PRL蛋白之间的氨基酸序列同源性较高，但是将鸡PRL ELISA试剂盒应用于水禽PRL的定量检测，目前尚无文献报道。目前市场上销售的一些鸭和鹅PRLELISA检测试剂盒，其检测灵敏度无法验证，且不能实现鹅PRL的定量检测。此外，这些商品化试剂盒中所使用的PRL标准品大多是从动物垂体中提取的天然PRL蛋白，其提取纯化的工艺步骤复杂、难度大、产量低，使得目前的试剂盒售价均高昂。

成熟的人PRL蛋白是由199个氨基酸残基组成的多肽，分子量为23kD。但是，正常人的血清中存在着多种形式的PRL异构体，分子量主要为16，22，23，48和56kD。这些不同分子量的PRL异构体是由PRL转录产物的可变剪接，翻译后修饰(如糖基化和磷酸化)以及多聚体化等原因造成的，其对于PRL生理功能的发挥具有重要作用。已有文献报道，以兔抗鸡PRL多克隆抗体为检测抗体，在鸡和鹅垂体提取物中均发现了从20-45kD范围内5种不同分子量的PRL异构体，这表明在鸡和鹅体内也存在着多种PRL异构体。因此，在开发禽类PRL的ELISA检测方法时，抗PRL抗体是否能够特异性识别多种PRL异构体是至关重要的。目前，文献报道的兔抗鸡PRL多克隆抗体是采用鸡垂体提取的天然PRL蛋白作为抗原获得的。由于动物体内天然蛋白的提取困难，通常采用基因工程技术生产的重组蛋白作为替代品来获得抗PRL抗体。目前，基因工程技术多采用原核蛋白表达系统生产重组蛋白，该重组蛋白不存在翻译后修饰，与天然蛋白相似度较低。随着对水禽卵泡发育和产蛋调控技术等研究的深入，迫切需要开发一种适用于测定水禽PRL的ELISA检测方法。

发明内容

针对上述问题，本发明利用基因工程技术制备鹅PRL重组蛋白，并通过制备相应的高特异性抗体，建立了一种具有灵敏度高、特异性强、准确、方便操作的鹅PRL双抗体夹心ELISA检测方法，本发明是通过如下技术方案实现的：

一种鹅催乳素的双抗体夹心ELISA检测方法，其特征在于，以鹅PRL多克隆抗体为捕获抗体，生物素标记PRL抗体为检测抗体，鹅PRL重组蛋白作为标准品，进行ELISA定量检测；所述鹅PRL重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。