[发明专利]一株缺失E蛋白离子通道活性的传染性支气管炎重组病毒及制备方法与应用

权利要求书

1.一株缺失E蛋白离子通道活性的传染性支气管炎重组病毒，其特征在于：是将野生型传染性支气管炎病毒的E蛋白的第26位氨基酸由丙氨酸突变为苯丙氨酸，得到的缺失E蛋白离子通道活性的传染性支气管炎重组病毒；

所述的野生型传染性支气管炎病毒的E蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；

所述的缺失E蛋白离子通道活性的传染性支气管炎重组病毒的E蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.根据权利要求1所述的缺失E蛋白离子通道活性的传染性支气管炎重组病毒，其特征在于：

编码所述的野生型传染性支气管炎病毒的E蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；

编码所述的缺失E蛋白离子通道活性的传染性支气管炎重组病毒的E蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

3.权利要求1或2所述的缺失E蛋白离子通道活性的传染性支气管炎重组病毒的制备方法，其特征在于包含如下步骤：

（1）将横跨整个传染性支气管炎病毒基因组的名称为片段A、片段B、片段C、片段D和片段E的克隆入克隆载体中，得到重组载体A、重组载体B、重组载体C、重组载体D、重组载体E，其中，E蛋白在重组载体E上；在构建过程中，将限制性位点分别导入到5个片段的5’端和3’端，在A片段中还将T7启动子序列插入IBV基因组5’端的上游，利用T7聚合酶促进体外转录；

（2）以重组载体E为模板，通过带有突变位点的引物扩增，获得E蛋白突变的E片段；将E蛋白突变的E片段克隆入克隆载体中，得到重组载体E’；

（3）将片段A、片段B、片段C、片段D和E蛋白突变的E片段，得到的连接产物进行纯化，再在体外转录，得到全长转录本；以线性化的pKTO-IBV-N质粒为模板，体外转录得到N转录本；用DNaseⅠ处理全长转录本和N转录本，纯化，得到纯化后的全长转录本和N转录本；

（4）用步骤（3）纯化后的全长转录本和N转录本电转至非洲绿猴肾细胞株Vero细胞，出现典型细胞病变，即获得缺失E蛋白离子通道活性的传染性支气管炎重组病毒。

4.根据权利要求3所述的缺失E蛋白离子通道活性的传染性支气管炎重组病毒的制备方法，其特征在于还包括如下步骤：

（5）收集含有缺失E蛋白离子通道活性的传染性支气管炎重组病毒的细胞上清，用无血清的培养基稀释；

（6）将稀释好的上清病毒感染到铺好Vero细胞的6孔培养板中，待Vero细胞吸附病毒后弃去上清，用无血清的培养基清洗细胞；然后在细胞上覆盖一层含琼脂的培养基，37℃培养至细胞出现病变；

（7）在步骤（6）最终处理好的6孔板中加入中性红溶液，染色，未被感染的细胞呈现红色，而形成的空斑变为透明色；用记号笔将空斑的轮廓描画出来，空斑尽量选择相距比较远的并且形态大小不同的；

（8）用无血清的培养基清洗铺好Vero细胞的12孔板，加入无血清培养基；将步骤（7）中做好记号的空斑上的琼脂转移到铺好Vero细胞的12孔板的中；

（9）放进37℃培养箱中培养；当在某些孔中观察到细胞100%病变，将该细胞冻融若干次，取部分样品提取其RNA进行基因测试，将序列正确的病毒扩增病冻存起来，得到纯化后的缺失E蛋白离子通道活性的传染性支气管炎重组病毒。