[发明专利]一种基因敲除选育pdlim5b基因缺失型斑马鱼的方法

说明书

本发明涉及基因敲除技术领域，特别是公开了一种基因敲除选育pdlim5b基因缺失型斑马鱼的方法，通过CRISPR/Cas9基因编辑技术，在斑马鱼的pdlim5b基因上设计合适的打靶位点，在体外合成的特异性gRNA和Cas9‑蛋白，显微共注射进入斑马鱼一细胞内，+胚胎培养48h后，通过选取胚胎进行基因型分析，从而证实了所选位点的有效性。本发明能更高效且更精确地在生物体基因组中沉默特定基因，且制作简单、成本低，且可同时对靶基因上多个位点进行剪切，沉默任意数目的单个基因。且干扰掉pdlim5b基因斑马鱼胚胎出现明显的发育畸形。

技术领域

本发明涉及基因敲除领域，特别是公开了一种基因敲除选育pdlim5b基因缺失型斑马鱼的方法。

背景技术

pdlim5b（ PDZ and LIM domain 5b ）基因位于斑马鱼第10号染色体上，包含17个外显子和16个内含子，cDNA全长1887bp，编码628个氨基酸，pdlim5b包含有9个进化上保守的功能结构域，同时通过基因差异表达谱分析和基因组关联分析等，发现pdlim5（pdlim5b在人类中的同源基因）在人类胚胎早期的多个组织中都有表达，特别是心脏中强烈表达。

发明内容

斑马鱼与人类心脏发育过程中的基因、信号通路有高度同源性，且pdlim5b基因进化上较为保守，研究发现pdlim5b在斑马鱼胚胎早期表达量特别高。而且，与其他动物模型相比，斑马鱼具有个体小、易于饲养、发育快、繁殖能力强、体外受精、胚胎体外发育且透明等优点。

通过CRISPR/Cas9基因编辑技术，在斑马鱼的pdlim5b基因上设计合适的打靶位点，在体外合成的特异性gRNA（终浓度20 ng/μL）和Cas9蛋白（终浓度5 μg/μL），显微共注射进入斑马鱼一细胞内，胚胎培养48h后，通过选取胚胎进行基因型分析，鉴定所设打靶位点的有效性。

基因打靶技术起源于20世纪80年代末，是一种通过对基因组进行定点修饰来研究基因功能的重要方法手段，也可用于治疗人类的各种遗传性疾病。该技术主要是利用缺失突变、基因灭活、染色体大片段删除以及外源基因导入等方式来改变生物的遗传信息，并且在生殖系中稳定遗传后表达突变性状，从而研究生物体内特定基因在生长发育过程中的作用，所以这类技术手段已成为现代分子生物学研究热点。传统的基因打靶技术是建立在胚胎干细胞(ESC) 和同源重组技术的基础之上，故打靶技术效率极低。2013年初，一种全新的人工核酸内切酶clustered regularly interspaced short palindromic repeats(CRISPR)/CRISPR-associated(Cas)9，能更高效且更精确地在生物体基因组中沉默特定基因，且制作简单、成本低，且可同时对靶基因上多个位点进行剪切，沉默任意数目的单个基因，但同时该技术存在一定的缺陷，其脱靶率相对较高。

发明内容

本发明为了克服上述技术问题的不足，提供了一种基因敲除选育pdlim5b基因缺失型斑马鱼的方法，找到了合适的打靶位点，通过CRISPR/Cas9基因编辑技术，选育出pdlim5b基因缺失型斑马鱼

解决上述技术问题的技术方案如下：

1）设计CRISPR/Cas9基因敲除靶位点和检测引物