[发明专利]成纤维前体细胞培养及其鉴定方法

说明书

本发明涉及一种成纤维前体细胞培养及其鉴定方法，按照先后顺序包括以下步骤：TAF的培养；RNA提取和PT‑PCR；流式细胞仪检测；免疫荧光检测；诱导分化；克隆成型。本发明对分离得到的TAF细胞做了初步鉴定，并且对裸鼠注射和组织学检查结果显示，本发明得到的大腿皮肤成纤维前体细胞能够产生I型胶原蛋白，促进真皮层的厚度，回复皮肤弹性，并且达到了一次取材、持续扩增的目的，减少了患者的痛苦，具有创伤小，疗效自然、持久等优点。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种成纤维前体细胞培养及其鉴定方法。

背景技术

随着我国经济的发展，人们的生活质量得到提高，美容整形技术也迅猛发展，各种组织工程生物材料不断应用于面部美容与创伤治疗的修复，当前美容医学的发展也趋于简单、微创和安全的方向发展，而面部老化的治疗也是从过去的搜书治疗向生物医学制剂注射治疗开始转化，当前主要的生物注射制剂有胶原蛋白、透明质酸酶、胚胎干细胞和肉毒素等，除肉毒素是作用于面部动态皱纹外，其他的均适用于治疗皮肤老化所致的细小皱纹。胶原蛋白和透明质酸酶是真皮组织细胞外界质的主要成分，在皮肤中主要起生物替代作用，使老化皮肤逐渐减少的真皮厚度与细胞外基质得到补充，具有除皱效果明显、起效快的特点；但这些成分多数是异体或异种成分，存在免疫排斥的过敏反应的可能，且生物代谢作用使之很快降解，效果持续时间短暂是这类产品的主要缺陷。

近年来欧美研究学者应用自体成纤维细胞进行治疗，其过程简述为从治疗者的皮肤中分离出成纤维前体细胞(TAF)，体外扩散后，注射到治疗者的凹陷或皱纹部位，达到修复皮肤缺损的治疗效果。但是目前尚未有对TAF在改善皮肤缺损和除皱整形方面有效的培养和鉴定方法。

发明内容

为解决现有技术中存在的问题，本发明提供一种成纤维前体细胞培养及其鉴定方法，按照先后顺序包括以下步骤：

(1)：TAF的培养：取人大腿皮肤样品切块后用PBS中冲洗，再加入DMEM培养液，于培养箱中传代培养，以MTT法测定TAF的生长曲线，实验选取P5-P10代的细胞；

(2)：RNA提取和PT-PCR：提取上述细胞的RNA，取高纯度RNA进行PCR检测，PCR产物再经凝胶电泳分析；

(3)：流式细胞仪检测：取P5代TAF细胞冲洗过滤，调整细胞浓度，每管分别加入PE标记的CD90、CD105、同型对照但荧光标记抗体，低温处理后，进行流式细胞仪检测；

(4)：免疫荧光检测：将TAF细胞与Brdu共同培养，传代扩增培养，应用抗Brdu的抗体进行检测，将人大腿皮皮肤组织块固定，包埋，切片后，用抗I型胶原的单克隆抗体4℃孵育过夜，再用TITC标记的山羊二抗染色并观察；

(5)：诱导分化：取TAF细胞，接种到细胞培养皿中贴壁培养，更换为诱导培养液诱导培养，再更换为维持培养液维持，然后更换为诱导培养液，依次循环，采用油红O染色，再观察；

(6)：克隆成型：配制琼脂溶液，灭菌，至于细胞培养箱中静置晒干，取TAF细胞加入DMEM培养基和琼脂溶液中培养，再观察并统计克隆数。

优选的是，步骤(1)中，所述DMEM培养液包括DMEM、10％FBS、100U/ml青霉素、100U/ml链霉素，培养条件为37℃、5％CO₂培养箱中培养。

在上述任一方案中优选的是，步骤(2)中，PCR检测的特异性的基因包括：HLA-I，HLA-DR，RT-PCR。

在上述任一方案中优选的是，步骤(2)中，PCR检测反应循环参数为：95℃预变性5min；94℃变性30S，55℃退火45S,72℃延伸10min。