[发明专利]一种检测加热不燃烧卷烟总粒相物细菌回复突变实验的方法

权利要求书

1.一种检测加热不燃烧卷烟总粒相物细菌回复突变实验的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)样品前处理：采用直线型吸烟机，在抽吸容量为55.0mL，持续时间3s，抽吸频率为30s的抽吸条件下，连续抽吸10口，用直径为44mm的剑桥滤片捕集，分别于抽吸前、抽吸后称量烟气捕集器的质量，按照公式(1)计算加热不燃烧卷烟总粒相物的质量mTPM；

mTPM＝m₁-m₀ (1)

式中：

m₀——抽吸前烟气捕集器的质量，单位为毫克(mg)；

m₁——抽吸后烟气捕集器的质量，单位为毫克(mg)；

捕集完毕后，将捕集后的剑桥滤片放入50mL的三角瓶中，加入二甲基亚砜，使加热不燃烧卷烟总粒相物在二甲基亚砜中的浓度为40mg/mL；将此三角瓶置于超声仪上超声30min；再用无菌滤纸过滤收集二甲基亚砜萃取液，分装至1mL的冻存管中，-80℃保存待用；

(2)受试菌的培养：将TA98和TA100鼠伤寒沙门氏工程菌分别加入到装有培养基的无菌三角瓶中，置于37℃条件下，静置培养16h或100次/min振荡培养10h；

(3)受试菌浓度的确定：用紫外分光光度计分别测定步骤(2)培养所得TA98和TA100鼠伤寒沙门氏工程菌在600nm下的OD值，然后用培养基稀释菌液至其OD₆₀₀值为0.5数；

(4)S9混合液的配制：将1.65mol/L的氯化钾溶液和0.4mol/L的氯化镁溶液按照1:1的体积比混合后配制成氯化钾-氯化镁溶液；取磷酸缓冲液、氯化钾-氯化镁溶液、0.05mol/L的葡萄糖-6磷酸钠盐缓冲液和0.025mol/L的辅酶-Ⅱ溶液，按照30:2:5:8的体积比混合，用0.22μm无菌过滤器过滤除菌后，与S9代谢活化液按照9:1的体积比混合，配制成S9混合液备用；

(5)受试物分组：将受试物分为四组：自发回变组、溶剂对照组、阳性对照组和样品测试组；把步骤(1)中制备的样品用PBS稀释成1000μg/mL的工作液备用，其中，样品测试组按表1所示的不同剂量将工作液加入15ml离心管中；自发回变组、溶剂对照组和阳性对照组则按表2所示的不同剂量将工作液加入15ml离心管中；将自发回变组、溶剂对照组、阳性对照组、样品测试组样品分别按表3所示的4个检测体系加样；

(6)受试物的培养：将步骤(5)中的各组受试物分别加入到2.0mL，40℃水浴保温的0.6％(W/V)琼脂顶层培养基中，混匀后迅速倒入1.8％(W/V)琼脂底层培养基中，转动平皿使顶层培养基均匀分布在底层上，平放固化，每个剂量设3个复皿，置于37℃、5％CO₂培养箱中培养48h，观察结果；

(7)结果判定：计算培养长出的回变菌落数，在背景生长良好的条件下，样品测试组诱发的回变菌落数等于或大于自发回变组菌落数的2倍以上，并有剂量效应关系，即认为样品测试组试验结果为阳性。