[发明专利]一种胎盘来源的造血干细胞制备方法

权利要求书

1.一种胎盘来源的造血干细胞制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1，胎盘于医院进行采集后，使用采血袋或注射器将脐带内部的脐带血全部采集，或者将脐带剪开把残留的脐带血全部弃去；

S2，对采集的胎盘灌注采集保护液进行预处理，该采集保护液的成分为每100ml的CPDA含30mg的罂粟碱，利用一次性注射器吸取采集保护液从脐带的动脉灌注80ml的采集保护液至胎盘组织后结扎脐带，预处理30min；

S3，在洁净环境下,生理盐水清洗胎盘外表面后，利用一次性注射器吸取细胞动员液从脐带的动脉灌注，当静脉流出来的液体为动员剂时，结扎动静脉后置于室温4h；

S4，松开动静脉，一次性注射器吸取80ml的细胞消化液灌注进胎盘中的两条动脉，收集从静脉流出全部液体，结扎动静脉后置于37℃环境下2h；

S5，松开动静脉，一次性注射器吸取400ml的生理盐水灌注进胎盘中的两条动脉，收集从静脉流出全部液体；

S6，将收集的液体300g离心8min,弃去上清，细胞沉淀用DMEM基础培养基重悬至100ml；

S7，该细胞悬液和注射用6％羟乙基淀粉按照体积比1:1混合，室温静置40min,吸取上清至离心管中300g离心8min,弃去上清；

S8，收集的细胞沉淀：1倍红细胞裂解液体积比＝1:10的比例用1倍红细胞裂解液重悬细胞沉淀，涡旋震荡5s,室温下裂解残留的红细胞10min；

S9，细胞悬液300g离心5min,离心后弃上清，获得包含造血干细胞在内的单个核细胞，加入40ml DMEM培养基重悬细胞沉淀，300g离心5min,离心后弃上清，沉淀用用DMEM培养基重悬细胞，获得胎盘来源的造血干细胞。

2.根据权利要求1所述的一种胎盘来源的造血干细胞制备方法，其特征在于，所述S2，采集保护液的成分为每100ml的CPDA含30mg的罂粟碱，具体配制方法为99ml的CPDA加入1ml(30mg/ml)的罂粟碱注射液。

3.根据权利要求1所述的一种胎盘来源的造血干细胞制备方法，其特征在于，所述S3，细胞动员液的成分为每500ml DMEM含有青霉素-链霉素双抗5ml、AMD3100 5mg、30mg罂粟碱，其中AMD3100为一种人工合成的大环类SDF-1受体CXCR4特异性拮抗剂。

4.根据权利要求1所述的一种胎盘来源的造血干细胞制备方法，其特征在于，所述S4，细胞消化液的成分为每100ml DMEM含有Ⅰ型胶原酶100mg、胰蛋白酶50mg、青霉素-链霉素双抗1ml、EDTA20mg。

5.根据权利要求1所述的一种胎盘来源的造血干细胞制备方法，其特征在于，所述S1，选取肝炎、梅毒、艾滋病等传染病检测阴性且无产科并发症的胎盘，术前经得产妇知情同意并签署知情同意书，术前准备无菌聚苯乙烯胎盘采集盒作为运送容器，内装胎盘采集保护液和注射器，采集前4℃条件下暂存于医院。

6.根据权利要求1所述的一种胎盘来源的造血干细胞制备方法，其特征在于，所述S2，采集后4℃条件下12小时内送到制备处。

7.根据权利要求1所述的一种胎盘来源的造血干细胞制备方法，其特征在于，所述S3，洁净环境为无菌生物安全柜内。