[发明专利]一种脑膜炎球菌fHbp蛋白的表达系统

说明书

本发明提供了一种脑膜炎球菌fHbp蛋白的表达系统，所述的表达系统包含fHbp抗原基因和载体pCAMBIA1301，所述的表达系统为pCAMBIA‑fHbp，所述的启动子为β‑phaseolin启动子。通过设计合成了fHbp拟南芥密码子偏好的核苷酸序列全长，将其亚克隆入带有菜豆种子特异启动子的植物表达载体中，利用农杆菌介导将fHbp基因整合到拟南芥基因组中。使fHbp在种子中表达，简化了生产工序，降低了生产成本，使植物大量生产口服疫苗fHbp成为可能。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种脑膜炎球菌fHbp蛋白的表达系统。

背景技术

脑膜炎球菌疾病因高发病率和高死亡率使其成为一个严峻的全球公共卫生问题。全世界几乎每年有50多万侵扰性脑膜炎疾病的病例，其中有6万的病人留下了严重的后遗症。在发展中国家2％的出生儿童5岁前死于脑膜炎。人类几乎所有的脑膜炎球菌病例是由A、B、C、W135和Y血清型引起的。Sanofi-Pasteur研制的A、C、W135和Y的四价荚膜多糖疫苗证明能有效预防这四种血清型。B群的荚膜多糖与人少数成熟组织神经细胞黏附分子同源。因此不能引起免疫。但是，Novartis利用“反向疫苗学”研制的含有4种外膜蛋白抗原的能预防脑膜炎球菌B群的疫苗已经进入III期临床，并且其中证明fHbp的免疫原性优于其他外膜蛋白。目前fHbp的基因工程化疫苗仍由原核表达系统表达。但其中高昂成本和产品中易含有热源的问题无法满足社会的需要，亟需一种全新的表达系统。

植物生物反应器的兴起，使低成本规模化生产基因工程疫苗，简化后期纯化工艺，以及产品不含热源方面体现出极大的技术优势，具有广阔的应用前景。

发明内容

本发明的目的在于提供一种脑膜炎球菌fHbp蛋白的表达系统。

本发明具体通过以下技术方案实现：

一种脑膜炎球菌fHbp蛋白的表达系统，所述的表达系统包含fHbp抗原基因和载体pCAMBIA1301，所述的表达系统为pCAMBIA-fHbp。

所述的表达系统中包含能使fHbp抗原基因在植物中高效表达的启动子，所述的启动子为β-phaseolin启动子。

所述的β-phaseolin启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

所述的表达系统中包括筛选标记，所述的筛选标记为Bar基因。

本发明上述β-phaseolin启动子在提高fHbp抗原基因在植物中高效表达中的应用也在本发明的保护范围之内。

所述的Bar基因在筛选表达系统pCAMBIA-fHbp中的应用也在本发明的保护范围之内。

另一方法，本发明还提供了制备上述表达系统的方法，具体包括以下内容：将本发明的包含fHbp的抗原蛋白基因，亚克隆入能使该基因高效表达的载体中，将能提高表达量的种子特异启动子，以及能筛选出转化植株的筛选标记的基因引入该表达系统中。

所述的表达系统引入的启动子为β-phaseolin启动子，所述的筛选标记为Bar基因，所述的载体为pCAMBIA1301。

在本发明的一个具体实施例中，可通过农杆菌感染法将上述构建体的fHbp基因的表达框和Bar基因表达框随机整合入植物基因组中，使植物能生产fHbp抗原蛋白。

在本发明的一个具体实施例中，设计Bar基因特异性引物对通过除草剂筛选呈阳性的植株进行PCR检测，去除掉PCR检测为阴性但抗除草剂的“假阳性”植株。

优选的，对Bar基因PCR检测筛选出的“Bar基因阳性植株”进行fHbp目的基因的PCR检测。去除转化过程中只有Bar基因整合入植物基因组而fHbp未整合入植物基因组的植物。通过两轮的PCR检测，确定了所有筛选出的拟南芥均含有fHbp目的基因和Bar筛选标记基因。