[发明专利]整合四拷贝功能性F18菌毛操纵子基因的益生菌克隆株、构建方法及应用

权利要求书

1.整合四拷贝功能性F18菌毛操纵子基因的益生菌克隆株，其特征在于，该益生菌克隆株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期为2018.8.13，保藏编号为CGMCCNo. 16253。

2.权利要求1所述的整合四拷贝功能性F18菌毛操纵子基因的益生菌克隆株的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

1） pTargetT-X::P_tetF18重组质粒的构建；X表示EcNc染色体上特定基因的靶标位点；

具体为：利用pB032-X/pB033扩增引物从pTargetF质粒DNA模板中反向PCR扩增含有靶标位点X的 N20序列的pTargetF-X线性化片段，随后对所得的线性化片段环化得到第一环化产物，第一环化产物转化入感受态细胞DH5α中以构建pTargetT-X重组质粒；XupsteamHA-F/XupsteamHA-R 和XdownsteamHA-F/XdownsteamHA-R扩增引物分别用来从Nissle1917基因组模板中扩增靶标位点的上游同源臂和下游同源臂；ptetFWD/ ptetF18REV-X 扩增引物用于从pBR322-F18 DNA模板中扩增带有P_tet启动子的F18菌毛操纵子基因；IPCRpTargetF-F(HindIII)/ IPCRpTargetF-R(PstI)用来线性化pTargetT-X重组质粒；使用ClonExpress^®MultiS一步克隆试剂盒，按照说明书要求，将靶标位点上游同源臂片段、下游同源臂片段、含P_tet启动子的F18菌毛操纵子基因片段、线性化的pTargetT-X片段一起进行环化得到第二环化产物；第二环化产物中，上述四个片段的环化连接排列的顺序为：靶标位点上游同源臂片段、含P_tet启动子的F18菌毛操纵子基因片段、靶标位点下游同源臂片段、线性化的pTargetT-X片段，四片段进行了环化连接得到第二环化产物；第二环化产物随后转化进感受态细胞DH5α中以构建pTargetT-X::P_tetF18系列重组质粒；X 代表EcNc染色体上特定基因的靶标位点，特定基因包括yjcS，cadAp，lacZ和yieN/trkD；

2）通过整合四拷贝功能性F18菌毛操纵子基因的益生菌克隆株的构建，得到无抗性的四拷贝F18菌毛基因整合克隆株；

具体为：pCas质粒电转化入益生菌EcNc中以构建EcNc/pCas重组菌株，制备EcNc/pCas感受态细胞，取EcNc/pCas感受态细胞与一种pTargetT-X::P_tetF18重组质粒混合，对EcNc/pCas感受态细胞和pTargetT-X::P_tetF18重组质粒组成的混合物进行电转化，电击产物置于冰冻的LB培养基孵育，之后于30℃摇床培养复苏，涂布于含卡那霉素和壮观霉素的LB平板中于30°C培养过夜；挑取抗性平板上生长的可疑阳性克隆株病利用菌落PCR鉴定，若出现大于5600bp的条带，则证明整合成功，测序并确定是否获得了阳性单拷贝F18整合株，再去除抗性质粒；之后，进行下一次整合试验和去除抗性质粒操作，直至最终得到无抗性的四拷贝F18菌毛基因整合克隆株；

所述pB032-X/pB033扩增引物的序列为：

pB032-yjcS：AGTCCTAGGTATAATACTAGTggatatgtggggtaacgacgGTTTTAGAGCTAGAAATAG；

pB032-cadAp：AGTCCTAGGTATAATACTAGTgttcgcagtggaagtaccgtGTTTTAGAGCTAGAAATAG；

pB032-lacZ：AGTCCTAGGTATAATACTAGTctggggaatgaatcaggccaGTTTTAGAGCTAGAAATAG；

pB032-yieN/trkD：AGTCCTAGGTATAATACTAGTgagggtgagccataatgaagGTTTTAGAGCTAGAAATAG；

pB033：ACTAGTATTATACCTAGGACTGAGCTAGCTGTCAAG；

XupsteamHA-F/XupsteamHA-R 和XdownsteamHA-F/XdownsteamHA-R扩增引物序列为：

yjcSupstreamHA-F：ttctctagagtcgacctgcagCTCGTTCCGCTCACACTTC；

yjcSupstreamHA-R：ataatggtttcttagacgtcATCCTGGCCGCGCACCTGATAC；

yjcSdownstreamHA-F：cagggtaatagatctaagcttACATTAATTTGGGGTTACGAT；

yjcSdownstreamHA-R：GGGTGACCAGGTCGCGAAGAATC；

pcadAupsteamHA-F：ttctctagagtcgacctgcagATCGAAAACAATGCGCGTCTG；

pcadAupsteamHA-R：ataatggtttcttagacgtcCACCATGTAGCTGCGGTCT；

pcadAdownsteamHA-F：ACTGCGAACAAAATTGTTGGT；

pcadAdownsteamHA-R：cagggtaatagatctaagcttATGTAGGCTTCGTTAAAGGTT；

LacZupsteamHA-F：ttctctagagtcgacctgcagCACACTACGCCTGAACGTTGA；

LacZupsteamHA-R：ataatggtttcttagacgtcTTCATTCCCCAGCGACCAGA；

LacZdownsteamHA-F：GCGCTAATCACGACGCGCTGTA；

LacZdownsteamHA-R：cagggtaatagatctaagcttCGGATAAACGGAACTGGAAATA；

yieN/trkDupsteamHA-F：ttctctagagtcgacctgcagAACCACAGACGAATCAGCATG；

yieN/trkDupsteamHA-R：ataatggtttcttagacgtcAGAATTTCCCGCCTGAGCAGT；

yieN/trkDdownsteamHA-F：GTTTCTTGCTGGTGGCTAAAA；

yieN/trkDdownsteamHA-R：cagggtaatagatctaagcttAAAGCTGCCGCCGATTAGCCC；

ptetFWD/ ptetF18REV-X 扩增引物序列为：

PtetF18REVyjcS：TCTTCGCGACCTGGTCACCCttagaattactgtatctcgaaaacaat；

PtetF18REVpcadA：CCAACAATTTTGTTCGCAGT ttagaattactgtatctcgaaaacaat；

PtetF18REV LacZ：CAGCGCGTCGTGATTAGCGCttagaattactgtatctcgaaaacaat；

PtetF18REV yieN/trkD：TTTTAGCCACCAGCAAGAAAttagaattactgtatctcgaaaacaat；

IPCRpTargetF-F(HindIII) 和IPCRpTargetF-R(PstI)的序列为：

IPCRpTargetF-F(HindIII)：AAGCTTAGATCTATTACCCTGT；

IPCRpTargetF-R(PstI)：CTGCAGGTCGACTCTAGAGAA。