[发明专利]一种蛋白质标签载体的构建及其表达与检测方法

说明书

本发明公开了一种蛋白质标签载体的构建及其表达与检测方法，涉及生物标记技术领域，本发明以果蝇卵巢生殖细胞特异性高表达的nos基因为实例，开发了一种细胞内源性的蛋白质标记技术，即基于末位外显子标记的蛋白质标签技术；首先，借助于分子克隆技术，构建nos基因最后一个外显子嵌合有GFP标签序列转基因载体；其次，借助于果蝇成熟的转基因技术，制备出携带此转基因载体的果蝇，通过检测其卵巢细胞内nos基因表达产物GFP荧光的表达与否，此技术为模式生物果蝇基因的表达模式研究提供了便利，为哺乳动物基因的表达及定位的研究提供借鉴。

技术领域

本发明涉及生物标记技术领域，特别是指一种蛋白质标签载体的构建及其表达与检测方法。

背景技术

RNA剪接过程是从mRNA前体分子中切除被称为内含子的非编码区，并使基因中被称为外显子的编码区拼接形成成熟mRNA的过程。它是真核细胞基因表达中非常重要的一个生物过程，通过RNA剪接，可以产生许多具有功能的，带有编码信息的mRNA，它对生物的发育及进化至关重要。RNA剪接体负责RNA剪接过程，具体来说，是在mRNA初始转录产物(Precursor mRNA，简称pre-mRNA)外显子和内含子交界处切断RNA，然后将外显子依次连接起来，切去内含子，构成一条完整的mRNA。研究表明，真核细胞pre-mRNA的剪接位点存在一定的序列保守性，内含子5'端(供体位点)和3'端(受体位点)的碱基几乎都是GT和AG，因此称为GT-AG法则。已有的研究大多集中在剪接位点的序列识别机理、剪接的体外重构以及剪接调控等方面。

GFP蛋白称为绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein，GFP)，由下村修等人1962年在水母中发现，其由GFP基因编码。该蛋白在蓝色波长光线激发下会发出绿色荧光，正是此特点，使得GFP蛋白作为标签蛋白在生命科学领域被广泛使用。GFP介导的融合蛋白标签技术是20世纪末兴起的一种基于报告基因的重组DNA技术，此标签技术可应用于体内基因表达水平的检测、蛋白质的细胞内原位示踪与定位、目标蛋白的纯化以及增强重组蛋白质的可溶性及稳定性等。基因nanos(简称为nos)非常保守，广泛存在于线虫、家蚕、斑马鱼、爪蟾、小鼠和人类等许多物种中。nos对于个体发育、生殖细胞的维持以及原始生殖细胞迁移与决定等都发挥着重要的调控作用。在果蝇中，nos基因高表达于早期胚胎细胞、原始生殖细胞、成熟生殖器官卵巢和精巢中。

基于对mRNA剪接原理、GFP蛋白质标签技术、分子克隆技术及成熟的果蝇转基因技术的研究，发明人发现果蝇基因的表达模式一般是先将GFP与靶基因编码序列的融合序列，放在靶基因启动子后面构建成果蝇转基因载体；然后通过显微注射手段得到转基因果蝇，以示踪靶蛋白的表达模式与亚细胞定位。存在以下问题：其一，靶基因有效的启动子长度存在不确定性。启动子设计得过短可能无效，不表达GFP融合蛋白，设计得过长扩增时存在难度。其二，基因工程手段构建的转基因载体整合入果蝇基因组后，其融合基因的表达是对内源靶基因的模仿，与体内原位表达存在或多或少的差异。其三，靶基因的编码序列需要从特异组织中提取总mRNA，然后进行反转录获得cDNA，最后通过基因扩增获得。整个过程相比较于本专利开发的技术，耗时耗力，且成本提高。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提出一种蛋白质标签载体的构建及其表达与检测方法，用于克服上述现有技术中的全部或者部分不足。

基于上述目的本发明提供的一种蛋白质标签载体的构建方法，包括如下步骤：

(1)果蝇nos基因3'UTR-AS序列的扩增，得nos3'UTR-AS，且其碱基序列为SEQ IDNO.1；

(2)pattB-nosP-3'UTR-AS过渡载体的构建；

(3)act5c基因ATG上游4550bp序列的扩增，得扩增前的碱基序列为SEQ ID NO.2；

(4)pattB-act5cP-3'UTR-AS过渡载体的构建；