[发明专利]一种黏附型细胞支架及其制备和应用

说明书

本发明涉及一种以果胶为基础材料的细胞黏附型支架的制备方法及其应用。其特征在于以果胶为初原料，通过接枝改性的方法制备得到细胞黏附性果胶，将细胞、微生物等生物活性物质与壁材混合后逐滴加入固化液中，固化形成载生物活性物质支架。所述方法制备工艺简便，过程绿色环保；所得支架细胞黏附性强，内部孔隙大，利于细胞的黏附及成团生长。这种黏附性高分子支架可用于细胞培养、组织修复、药物筛选、药物安全性评价等方面。

技术领域

本发明涉及生物工程及生物医药领域，具体地说是一种以改性果胶为基质载体的高黏附性细胞支架，该支架可用于细胞、微生物等生物活性物质的培养或包埋，该方法工艺简便，细胞黏附性好、内部孔隙率大，生物活性好，可实现高密度、高活性培养。

研究背景

果胶是一种广泛存在于陆生高等植物细胞壁中的杂多糖，其分子质量5-40万之间。果胶具有良好的生物相容性，是FAO/WHO推荐的不受添加量限制的食品添加剂，常用作增稠剂、稳定剂、乳化剂、悬浮剂以及食品保鲜材料等。此外，在生物医药领域，果胶还可用作靶向制剂、基因载体等载体材料。近年来，由于果胶所具有的成凝胶性能，其应用扩展至组织工程领域。与现有应用最为广泛的天然多糖材料——海藻酸相比，果胶与钙离子具有更多的结合位点和更强的化学结合力，因此所成凝胶具有更好的化学及结构稳定性，更适合细胞及活性物质的包埋(Journal of applied polymer science,135(2018):45685(1—9))。

细胞黏附是细胞与载体材料间产生的第一步相应，影响后续细胞的铺展、迁移、分化、凋亡等生物学行为。普通水凝胶，无论天然多糖类或合成高分子制备所得，由于缺乏适宜的细胞/基质贴附界面及亲和位点，贴壁细胞的黏附与铺展均到不同程度的限制，影响了装载细胞的活性(Biomaterials,35(2014)4636–4645)。通过在材料中引入黏附位点，提高凝胶材料与细胞的亲和力，是促进细胞与凝胶基质间的黏附及提高水凝胶微反应器内细胞活性的有效手段(J.Biomed.Mater.Res,39(1998)266–276)。F.Munarin等采用接枝修饰果胶，制备出用于软骨再生及组织修复的果胶钙水凝胶注射剂。结果表明改性果胶可有效增强水凝胶体系与细胞黏附性，细胞的生物活性与增殖得到提高(Biomacromolecules,12(2011)568–577)。

因此，为解决现有天然果胶在组织工程应用中存在的问题，提高载体支架材料与细胞间作用，从而进一步提高装载细胞及生物活性物质的活性及稳定性，本发明开发了一种黏附型细胞支架的制备方法及应用。该方法通过接枝改性的方法提高果胶材料表面氨基数量，增加了材料与细胞间的相互作用位点及分子间作用力，从而提高材料与细胞间的黏附作用力。该方法制备工艺简便，过程绿色环保，可提高材料和装载细胞间的相互作用力，有效提高装载细胞的活性。

发明内容

针对目前常用天然高分子载体材料与细胞间相互作用力较弱的问题，本发明提供了一种以果胶为初原料，通过接枝改性的方法，提高载体材料与装载物之间的相互作用力，并最终提高装载物活性的方法。

为实现上述目的，本发明选用果胶为初原料，通过接枝改性的方法，制备高包埋活细胞或其他生物活性物质，所述方法包括以下步骤：

(1)称取果胶粉末溶于蒸馏水中，过夜溶胀，搅拌至完全溶解；

(2)加入乙二胺，将pH调节为5.3～5.6，充分搅拌至互溶；

(3)加入过量的碳二亚胺(EDC)至步骤(2)制得的混合溶液中，搅拌充分反应；

(4)将步骤(3)溶液移入透析袋中，蒸馏水透析除去未反应的过量氨基；

(5)将步骤(4)中制得的溶液干燥，得改性果胶；

(6)将步骤(5)中制得的改性果胶原料溶液生理盐水中，搅拌至完全溶解后无菌过滤。

(7)将步骤(6)所得混悬液注入模具中，经固化交联后即得黏附型支架。