[发明专利]MIF和TIPE2双基因共表达重组腺病毒及其制备方法和应用

说明书

本发明公开了一种MIF和TIPE2双基因共表达重组腺病毒及其制备方法和应用，该所述重组腺病毒基因组中包含一个MIF和TIPE2双基因表达盒，所述MIF和TIPE2双基因表达盒由上游至下游依次包含EF1α启动子、MIF基因、终止子、内部核糖体进入位点IRES、TIPE2基因和终止子；该重组腺病毒的制备方法简单,成本低；将其体外转染巨噬细胞再回输脑出血的血肿周围组织，能够抑制巨噬细胞，有效抑制脑出血的炎症反应和脑水肿，并提高神经功能评分，为脑出血的治理提供理想的策略，在脑出血的治疗领域具有良好的开发应用前景。

技术领域

本发明属于医药生物技术领域，涉及一种重组腺病毒，具体地说是一种MIF和TIPE2双基因共表达重组腺病毒，以及该重组腺病毒的制备方法和应用。

背景技术

脑出血为常见的急性脑血管病，是一种常见的神经系统危重症，因其高发病率，高致残率，高死亡率而受到广泛关注。根据最新统计数据显示，每年脑出血死亡患者人数约为全部疾病死亡患者人数的20%。目前脑出血的内科治疗以脱水降颅压，清除自由基，营养神经及对症支持治疗为主，近年尚无突破性的治疗方法。研究表明，脑出血作为一种损伤因子诱发的炎性反应，可引起局部脑血流量的改变，诱导细胞因子的基因表达及其蛋白产物的生成，激活并趋化炎性细胞向损伤区域游走、浸润并释放多种生物活性物质。炎性反应一方面清除和吸收坏死组织和细胞碎片，并通过实质细胞或间质细胞的再生修复损伤；另一方面，炎性反应通过释放的多种酶及炎性介质，加重局部组织的水肿和神经细胞的破坏。

巨噬细胞迁移抑制因子( macrophage migration inhibitory factor，MIF) 是一类多效性的前炎症细胞因子，能够促进其他多种前炎症因子的分泌或表达。其基因在大多数哺乳动物基因组中具有90%的同源性。MIF启动子区含有能够与多种转录因子结合的DNA结合位点，同时含有与其表达水平相关的多态性位点。MIF 发挥其生物学功能，一方面可以通过非受体介导的内吞作用，实现 MIF与c-Jun激活结构域结合蛋白-1(JAB1)的相互作用; 另一方面，受体依赖型的MIF能够激活包括 PI3K/AKT、MAPK和G蛋白偶联受体相关的信号传导途径等。MIF已经被证实参与调解炎症、肿瘤生成和纤维化等生物学过程。

肿瘤坏死因子α诱导蛋白8样分子2(tumor necrosis factor-α-induced protein8-like 2,TIPE2)是肿瘤坏死因子α诱导蛋白8(tumor necrosis factor-α-inducedprotein 8,TNFAIP8)家族成员之一,最早在小鼠实验性自身免疫性脑脊髓炎动物模型中发现的,TIPE2主要表达于胸腺、淋巴结、脾脏及小肠粘膜等,在巨噬细胞、T淋巴细胞和B淋巴细胞等免疫细胞中高表达,在免疫反应中发挥重要的负向调节作用。TIPE2参与多条信号通路的调控,如JNK、NF-kB等。研究发现TIPE2在系统性红斑狼疮、慢性乙肝病毒感染及哮喘中表达均有改变。TIPE2在系统性红斑狼疮患者中表达下调,有研究发现TIPE2可以通过诱导M2型巨噬细胞极化减轻系统性红斑狼疮。

基因联合治疗的方式主要有两种：一是将多种分别携带不同基因的重组表达载体同时转染靶细胞，这种方式可以自由调节各重组表达载体的比例，但需要分别构建携带不同基因的重组表达载体，构建工作繁琐、费时，影响因素多；此外，由于转染过程具有一定随机性，转染后的细胞存在基因拷贝不均一的问题，既不利于目的基因的表达及后续治疗，又导致实验结果难于评估分析；上述缺点限制了此种方式的进一步应用。二是将两个或两个以上的基因由一个载体携带表达，这种方式可以通过多启动子载体、多顺反子载体或融合基因等调控手段提高基因转染效率，增加表达强度，并维持相对的表达比例，从而克服了前一种方式的不足，近年来日益受到研究者的重视。

巨噬细胞是体内的免疫调节细胞，可以在体内微环境的作用下，分化为促进或抑制免疫应答反应的免疫细胞。体外构建携带免疫抑制分子基因的重组病毒并转染巨噬细胞，再将其回输体内，已广泛应用于诱导免疫耐受等方面的治疗。

发明内容