[发明专利]一种用于提高卷枝毛霉产油量的二羧酸转运体

说明书

本发明涉及一种用于提高卷枝毛霉产油量的二羧酸转运体，属于基因工程领域，本发明从高产油卷枝毛霉WJ11克隆获得二羧酸转运体dit基因，连接至整合型质粒pMAT1552上，转化到卷枝毛霉缺陷型菌株Mu402中，通过同源重组将dit基因整合到卷枝毛霉的基因组上，得到重组菌株Mc‑Dit，最终实现了dit基因在卷枝毛霉MU402中的表达，过表达菌株Mc‑Dit胞内油脂脂肪酸组成变化不大，但在过表达菌株Mc‑Dit菌株油脂总脂肪酸含量提了33.76%，胞内油脂含量最多可以达到细胞干重的17.67%。

技术领域

本发明涉及一种用于提高卷枝毛霉产油量的二羧酸转运体，属于基因工程领域。本发明通过同源重组技术过量表达二羧酸转运体(dit)基因，大大提高卷枝毛霉中的油脂产量。

背景技术

现在，人民生活水平日益提高，越来越多的人重视身体健康与生活质量。膳食油脂的营养成分与慢性病的发生密切相关，油脂中重要的活性多不饱和脂肪酸，如γ-亚麻酸（GLA）、α-亚麻酸（ALA）、紫草酸（十八碳四烯酸、SDA）、二十碳五烯酸（EPA）、二十二碳六烯酸（DHA），可以调节体内脂质代谢，预防多种慢性疾病的发生。γ-亚麻酸为人体必需脂肪酸，是人体合成活性多不饱和脂肪酸的前体物质，需要从膳食中获得。目前工业化的γ-亚麻酸大多来源于植物，如月见草、玻璃苣油和黑加仑籽油。然而植物因受产地、气候的影响，生长周期短、产量不稳定，不能满足市场需求。因此，寻找新型油脂资源成为当前研究的热点。产油微生物由于其油脂含量高，生长周期短，碳源利用广谱等特点备受关注，通过微生物产生的油脂以及其衍生品来代替部分植物资源，可能在未来生物产油产业中发挥重要作用。产油微生物细胞工厂是指利用产油微生物，发酵过程中通过添加过量的碳源，如碳水化合物、碳氢化合物等，使得微生物胞内脂肪酸以甘油三酯的方式大量储存在自身体内，进而将细胞转变成工厂。

卷枝毛霉是全球首次利用微生物商业化培养生产油脂的菌株。卷枝毛霉被用来作为产油微生物研究的模式菌种，然而，本研究中分离获得新菌株WJ11，其所产生的脂质可以占到细胞干重的36%，且其基因组测序已完成，遗产背景与产油机制研究较为深入，同时其基因操作简单，遗传工具较为齐全，比较适于进行细胞工厂制备。卷枝毛霉能够大量产生对人体具有重要生理功能的γ-亚麻酸 (GLA)，这也是其主要的商业价值。

二羧酸转运体(2-oxoglutarate/malate transporter，dit)基因是脂质合成的关键因素之一。产油真菌通常在碳源充足，其它营养成分（如氮、磷、硫等）缺乏的条件下，线粒体中三羧酸循环受阻，导致柠檬酸大量积累在线粒体中，此时柠檬酸被转运到细胞质中由柠檬酸裂解酶裂解产生脂肪酸合成底物乙酰辅酶A和草酸乙酰。乙酰辅酶A为细胞中油脂合成前体物质，进而通过生化反应被用于合成脂肪酸，而脂肪酸则以甘油三酯的形式储存在细胞内，从而形成微生物油脂。据报道，二羧酸转运体能够将细胞质内的苹果酸等二羧酸透过线粒体细胞膜转运到线粒体内，进而促进柠檬酸的转出，为细胞油脂合成起到促进作用，因此二羧酸转运体对于微生物油脂合成与积累具有重要作用。本专利利用卷枝毛霉作为研究微生物产脂的细胞工厂的模式菌株，利用同源重组的基因工程方法来提高卷枝毛霉油脂产量，为大力推广卷枝毛霉的工业化应用提供指导，并且能够用微生物油脂提供高营养价值的多不饱和脂肪酸，符合人民对身体健康和高质量生活的日益增长的要求。

发明内容

本发明提供一种卷枝毛霉重组菌株Mu-Dit，包括二羧酸转运体（dit）基因在卷枝毛霉基因组上的整合并过量表达，与对照菌Mc1552相比生成的胞内油脂产量提高了33.76%，胞内油脂含量可以达到总脂肪酸的17.67 %。