[发明专利]一种含有ApcE2突变体的融合蛋白及其应用

说明书

本发明公开了一种融合蛋白，其特征在于：所述融合蛋白的氨基酸序列为：F1多肽—连接保护肽1—F2多肽—连接保护肽2—F1多肽，其中F1多肽为序列为SEQ ID No.1和SEQ ID No.2中的任意一种，F2多肽序列为SEQ ID No.3～SEQ ID No.14中的任意一种。本发明中通过将ApcE2突变体与经过基因工程改造的别藻蓝蛋白亚基BDFP1.1或BDFP1.2进行融合得到一种融合蛋白，提高了ApcE2突变体在哺乳动物细胞中标记的荧光较弱的问题。并且发现在荧光标记过程中体外添加光敏色素PΦB，可有效提高融合蛋白进行细胞标记时的亮度。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种含有ApcE2突变体的融合蛋白及其应用。

背景技术

现代生物学的发展越来越依赖光学技术，例如荧光成像、光学检测及光诱导操纵等等。在活体中对深层组织进行成像定位，最好选用650nm-900nm波段的荧光。因为这个波段的光自发荧光较小、光散射小且对组织损伤较小。近年来，作为荧光探针研究较多的两类蛋白为绿色荧光蛋白家族和细菌光敏色素蛋白(BphP)。

少数蓝细菌为了更适应环境、从环境中捕获更多的能量，慢慢进化出能利用远红光的藻胆体。这些藻胆体中通常存在不同于传统的核膜连接蛋白和一到三个别藻蓝蛋白亚基，其荧光发光机制类似于细菌光敏色素蛋白(BphP)，发色团为非共价结合的藻蓝胆素PCB。

另有研究，对来自蓝细菌Chroococcidiopsisthermalissp.PCC7203的别藻蓝蛋白亚基ApcF2进行基因工程改造，得到一系列远红光和近红外光的荧光蛋白，其被命名为BDFP荧光蛋白。其中的BDFP1.1，共价结合胆绿素BV后，最大吸收波长为682nm，荧光波长707nm；BDFP1.2，最大吸收波长为642nm，荧光波长668nm。BDFP系列荧光蛋白具有较小的分子量，能与色素共价结合，性能稳定，耐受极端环境；可用于对人类细胞系、线虫细胞等活体细胞进行标记，也适用于标记乳酸杆菌、质体、线粒体等。

最新的研究发现，ApcE2(1-273)，来自蓝细菌Synechococcussp.PCC7335，由S7335_3294编码，其序列中保守的半胱氨酸被缬氨酸替代，因此与色素是以非共价方式连接，其光谱均比共价连接色素的ApcE1红移近40nm。它与藻红胆素PEB重组，最大吸收峰在614nm，最大荧光峰在628nm；与藻蓝胆素PCB重组，最大吸收峰在700nm，最大荧光峰在714nm；还可以连接光敏色素PΦB，吸收进一步红移至714nm，荧光在726nm，为目前荧光标记所能达到的最长荧光发射波长。

由于ApcE2是膜蛋白，需要在含高浓度变性剂(3.5mol/L尿素)的条件下溶解；在室温下不够稳定，故而会影响标记。已有文献(缪丹.红移藻胆蛋白和光敏色素的研究及分子进化[D].2017.)报道：对蛋白N端、C端的截短及loop环(77-161)的部分缺失改造，并没有提高蛋白的可溶性。

申请人在研究中以ApcE2(24-245)为模板进行基因改造后，得到的BDFP3等系列蛋白，解决了可溶性问题，结合光敏色素PΦB后，可以对大肠杆菌细胞进行荧光标记，但是在哺乳动物细胞中标记的荧光较弱。

发明内容

本发明的目的在于提供一种含有ApcE2突变体的融合蛋白及其应用，解决ApcE2突变体在哺乳动物细胞中标记的荧光较弱的问题。

本发明所采取的技术方案是：

一种融合蛋白，其氨基酸序列为：F1多肽—连接保护肽1—F2多肽—连接保护肽2—F1多肽，其中F1多肽为序列为SEQ ID No.1和SEQ ID No.2中的任意一种，F2多肽序列为SEQ ID No.3～SEQ ID No.14中的任意一种。

进一步地，F2多肽序列为SEQ ID No.8～SEQ ID No.13中的任意一种。

进一步地，连接保护肽1的长度为10～20个氨基酸。