[发明专利]重组猪圆环病毒2型Rep蛋白、ELISA检测试剂盒及其制备方法与应用

说明书

本发明提供了重组猪圆环病毒2型(PCV2)Rep蛋白、ELISA检测试剂盒及其制备方法与应用。该重组PCV2 Rep蛋白的制备包括构建PCV2 Rep蛋白基因克隆载体及基因的改造；构建重组PCV2 Rep蛋白表达质粒载体、工程菌；重组PCV2 Rep蛋白的诱导表达及纯化；再用重组PCV2 Rep蛋白制备猪圆环病毒2型Rep蛋白抗体ELISA检测试剂盒，能检测出猪血清中PCV2野毒感染抗体和PCV2全病毒灭活疫苗或全病毒弱毒疫苗免疫抗体，而对PCV2 Cap蛋白基因工程亚单位疫苗免疫猪血清抗体检测呈阴性反应；结合PCV2 Cap蛋白抗体ELISA检测试剂盒的应用，可区分亚单位疫苗免疫猪与野毒感染猪，便于养猪场的PCV2病毒净化。

技术领域

本发明涉及生物制药技术领域，尤其涉及重组猪圆环病毒2型Rep蛋白、ELISA检测试剂盒及其制备方法与应用。

背景技术

猪圆环病毒(Porcine Circovirus,PCV)属于圆环病毒科、圆环病毒属，病毒无囊膜、是单链负股环状DNA病毒，是最小的动物病毒之一。到目前为止，已经发现猪圆环病毒存在3个基因型：猪圆环病毒1型(PCV1)、猪圆环病毒2型(PCV2)，和猪圆环病毒3型(PCV3)。其中PCV2和PCV3有致病性，而PCV1无致病性。病毒粒子直径约17nm，呈20面体对称结构。基因组大小约为1.76kb，含有2个主要开放性阅读框架(ORF)，其中ORFl基因产物与病毒复制酶相关(involved in virus replication，rep)，ORF2基因产物是构成病毒衣壳蛋白(Capsidprotein,简称：cap)成分。

加拿大科学家John Harding，于1991年报道了断奶仔猪多系统衰竭综合征(postweaning multisystemic wasting syndrome,PMWS)，后经研究证实猪圆环病毒Ⅱ型(Porcine circovirus 2，PCV2)是该综合征的主要病原。主要症状表现为渐进性消瘦、呼吸困难急促、贫血、腹泻、黄疸、间质性肺炎、淋巴结炎及肾炎等。近年来还发现猪皮炎与肾炎综合症(porcine dermatitis and nephropathy syndrome,PDNS)、猪呼吸道综合征(porcine respiratory disease complex,PRDC)、A2型先天性振颤(congenital tremor,CT)、猪增生性和坏死性肺炎(Porcine Proliferative and necrotizing Pneumonia,PNP)、繁殖障碍(Reproductive failure)等疾病都与PCV2有密切相关。

PCV2感染能引起一种临床综合征，主要侵害5-12周龄断奶仔猪，PCV2的危害在于能够使感染猪只的免疫功能受到损害，导致机体抵抗力下降，经常以亚临床感染的形式出现，易被忽视。由于PCV2感染使免疫系统受到损害，容易继发或并发其它感染性疾病，造成更大危害。本病呈世界流行，从2000年我国首次发现存在此病以来，已给我国养猪业造成了相当大的经济损失。但由于PCV2在体外培养时不产生细胞病变，病毒增殖能力差，采用传统的方法制备该病毒疫苗非常困难。

用基因工程的方法制备猪圆环病毒2型(PCV2)疫苗是控制该病的重要途径。在重组疫苗研究中PCV2的Cap蛋白基因是最为重要的备选基因，因为Cap蛋白是该病毒主要的结构蛋白，含有型特异性抗原决定簇。有研究资料报道，PCV2的中和性单克隆抗体和多克隆猪抗血清都能与cap蛋白相识别和发生中和反应。在基因工程疫苗中，重组基因工程亚单位疫苗是最为安全的疫苗，而且其免疫的效果也最为确定，只要抗原蛋白的量足够大就能产生相应的特异性抗体。目前国内市场上已有杆状病毒表达的PCV2 cap蛋白生产的基因工程亚单位疫苗，和用大肠杆菌表达的PCV2 Cap蛋白生产的基因工程亚单位疫苗。