[发明专利]一种基于秀丽线虫检测塑化剂多世代蓄积毒性的方法

说明书

本发明属于分析检测技术领域，特别涉及一种基于秀丽线虫检测塑化剂多世代蓄积毒性的方法，包括制备处于同一时期的秀丽线虫虫卵溶液进而获得幼虫溶液，制备大肠杆菌OP50菌液，浓度梯度进行染毒培养并计算塑化剂样品的LC50，在LC50的1/1000浓度的塑化剂样品浓度下分别获得P0代、F1代、F2代、F3代的寿命、体长、身体弯曲和头部摆动频率指标，评价塑化剂样品的世代蓄积毒性类别。本发明提供一种方便快捷、成本低廉、操作简单的用秀丽线虫测定邻苯二甲酸酯类塑化剂的跨世代蓄积毒性的方法，对模拟实际环境暴露情形下的毒性研究方法进行了补充和扩展。

技术领域

本发明属于分析检测技术领域，特别涉及一种基于秀丽线虫检测塑化剂多世代蓄积毒性的方法。

背景技术

秀丽线虫(Caenorhabditis elegans)是一种对环境因素变化非常敏感的模式生物，具有繁殖周期短、易于培养的优点，近年来被广泛应用于重金属、纳米材料的环境毒理学评价中。秀丽线虫遗传背景清楚，与高等动物具有相似的细胞分子结构以及信号通路，可以从宏观和分子水平解析环境毒物的毒效应及作用机制；运动速率、生长发育和生命周期等指标由于简单易测，常作为毒效应评价中的指标。

邻苯二甲酸酯类塑化剂是一类高分子材料助剂，因可以提高塑料的柔韧性而广泛应用于塑料玩具、各种包装材料、胶管、乙烯地板等产品中。用秀丽线虫测定塑化剂毒性的方法已经有所研究，其方法涉及塑化剂对秀丽线虫运动行为、代谢、脂肪积累及寿命等行为和代谢指标的影响等多个方面。塑化剂是一类存在于环境中的污染物，人类及生物体的实际接触方式是多世代、重复或持续、低剂量的接触，不会发生急性毒作用，但长期低浓度接触可能会产生预想不到的作用，研究与确定化合物的长期重复接触毒作用在化合物的毒性效应评价中至关重要。已有研究通常只在秀丽线虫生命周期的某一时间段接受暴露，并不是整个生命时期的暴露，没有考虑从卵发育到成虫的敏感时间段，也没有考虑秀丽线虫多个世代持续暴露的真实环境条件，因而还无法判断真实环境中的塑化剂所产生的毒效应及生态风险，无法表征塑化剂对环境生物及其子代的长期作用是否具有蓄积毒性效应。而如果采用传统蓄积毒性方法，则是以致死量作为评价终点的，也不能体现多世代持续低剂量接触的实际环境暴露水平。

发明内容

本发明提供一种方便快捷、成本低廉、操作简单的用秀丽线虫测定邻苯二甲酸酯类塑化剂的跨世代蓄积毒性的方法，对模拟实际环境暴露情形下的毒性研究方法进行了补充和扩展。

本发明提供了一种基于秀丽线虫检测塑化剂多世代蓄积毒性的方法，包括以下步骤：

S1，培养秀丽线虫至产卵期，用磷酸钾缓冲液清洗并收集产卵期秀丽线虫，再用裂解液裂解秀丽线虫母体并收集对裂解液有抵抗能力的虫卵，用磷酸钾缓冲液清洗，加入磷酸钾缓冲液调整秀丽线虫虫卵浓度为10枚/μL，得处于同一时期的虫卵溶液；

S2，将S1中的虫卵溶液培养12-18h，使虫卵孵化但保持在L1幼虫时期，将L1幼虫培养至L4幼虫时期，用磷酸钾缓冲液清洗并调整L4幼虫浓度为19-21条/100μL，得幼虫溶液；用磷酸钾缓冲液清洗并调整大肠杆菌OP50溶液在波长570nm时吸光度1.2-1.4，得菌液；

S3，设置不同的待检塑化剂样品浓度梯度，每个浓度塑化剂样品中依次加入S2中的幼虫溶液和菌液，20℃下染毒培养48h，4h/次记录虫体死亡数，计算塑化剂样品的LC50；

其中，塑化剂样品：幼虫溶液：菌液的体积用量比为2:1:1；

S4，配制LC50的1/1000浓度的塑化剂样品，加入S1中的虫卵溶液、S2中的菌液，20℃下染毒培养48h，记为P0代，然后分别测定P0代寿命、体长、身体弯曲和头部摆动频率指标；

其中，塑化剂样品：虫卵溶液：菌液的体积用量比为2:1:1；