[发明专利]基于高通量测序构建多种血友病靶向文库的引物组合、方法及试剂盒

说明书

本发明公开了一种基于高通量测序构建多种血友病靶向文库的引物组合、方法及试剂盒，本发明的引物组碱基序列为SEQ ID No.1～SEQ ID No.450，覆盖了F8、F9、F11、vWF、F2、F7和SRY共7个基因全部的外显子、剪接区以及部分启动子区和内含子区，共128个目标区域、225对引物，可同时一次性检测甲型血友病、乙型血友病、丙型血友病、血管性血友病、凝血因子II缺乏症和凝血因子VII缺乏症等全部6种疾病的基因突变位点。本发明可应用于血友病等先天性出血性疾病的致病位点检测、筛查和家系成员筛查及相应致病变异科学研究。该方法操作简单、准确性高、耗时短，大大的节约了Sanger测序逐个基因逐个片段去检测所用的时间成本和人力成本。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及基于高通量测序构建多种血友病靶向文库的引物组合、方法及试剂盒。

背景技术

血友病是一组遗传性凝血功能障碍的先天性出血性疾病，其共同的特征是某些凝血因子缺乏、活性凝血活酶生成障碍，凝血时间延长，终身具有轻微创伤后出血倾向，重症患者没有明显外伤也可发生“自发性”出血。2018年5月11日，国家卫生健康委员会等5部门联合制定了《第一批罕见病目录》，血友病被收录其中。大规模流行病学调查显示血友病的发病率为15-20/10万人，是先天性出血性疾病中最为常见的疾病。据文献报道，截至2007年5月，中国注册的血友病患者约8000人，而根据流行病学的推算，中国应该有6-10万名血友病患者，目前我国血友病的误诊和漏诊率较高(中国小儿血液与肿瘤杂志，2010，15：49-51)，究其原因，一方面可能与对疾病的认识不足、以及疾病表型和临床表现复杂多样化有关，另一方面与目前缺乏确诊的实验室检查方法有关。因此，建立快速、精准的检测技术，对我国血友病的早期识别和诊治有极其重要的意义。

常见的血友病包括甲型血友病(凝血因子VIII缺乏症)、乙型血友病(凝血因子IX缺乏症)和丙型血友病(凝血因子XI缺乏症)3类。另外，临床上还有血管性血友病、凝血因子II缺乏症、凝血因子VII缺乏症等凝血因子缺乏导致的先天性出血性疾病，临床表现多有相似，难以区分。这些疾病都有明确的致病基因和变异位点，因此，建立一种简单、快速、可同时检测多种血友病等先天性出血性疾病的致病基因变异位点的方法，有助于快速鉴别不同凝血因子缺陷导致的血友病和其他先天性出血性疾病。

甲型血友病，又称凝血因子VIII缺乏症，是F8基因突变导致凝血因子VIII功能缺陷所致的一种凝血功能障碍性遗传病，呈X连锁隐性遗传，男性发病，女性可携带致病基因，发病率约为1/5000的男性活婴，女性患者极为罕见。常见的致病变异包括F8基因内含子22倒位和内含子1倒位，约占甲型血友病的45-50％；F8基因外显子1至外显子26及其剪接区的点突变和小片段缺失，约占甲型血友病的45％-50％；F8基因大片段缺失，约占5％。F8基因的变异类型复杂多样，截至2018年2月，共报道F8基因无义突变和错义突变1428种、剪接位点变异160种、小片段插入或缺失503种、复杂重组12种。其中明确具有致病性的点突变、片段插入或缺失变异有283种，分布在F8基因全部的外显子、部分剪接区、启动子区上，另外内含子4上有致病变异c.601+1632GA位点。因此基因检测需要覆盖整个F8基因的外显子、剪接区、启动子区，才能不漏诊。

乙型血友病，又称凝血因子IX缺乏症，是F9基因突变导致凝血因子IX功能缺陷所致的一种凝血功能障碍性遗传病，呈X连锁隐性遗传，发病率约为男性活婴的1/30000。常见的致病变异为F9基因的点突变和小片段插入或缺失，分布在外显子、剪接区和启动子区，约占乙型血友病的97％；少数为大片段缺失，为外显子部分缺失，约占乙型血友病的3％。F9基因的变异类型也是复杂多样的，目前收录在美国NCBI临床疾病相关变异数据库(ClinVar，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/)中明确具有致病性的F9基因变异位点有117种。同样，基因检测需要覆盖整个F9基因的外显子、剪接区。