[发明专利]一种鲜切叶菜的菌群测定方法

说明书

本发明涉及蔬菜贮藏技术领域，具体涉及一种鲜切叶菜菌群测定方法，包括叶菜的清洗、去根和无菌分装处理，鲜切叶菜的细菌基因组DNA提取，高通量测序及数据分析。本发明提供的鲜切叶菜菌群测定方法，能够有效检测鲜切叶菜在不同贮藏时期的菌群变化，为鲜切叶菜的防腐杀菌与贮运等提供重要的依据。

技术领域

本发明涉及蔬菜贮藏技术领域，具体涉及一种鲜切叶菜菌群测定方法。

背景技术

鲜切蔬菜是以新鲜蔬菜为原料，经过分拣、清洗、切分、包装等一系列处理后制成的即用或即食的蔬菜制品，具有新鲜、便捷、营养等优点。但鲜切蔬菜本身含水量较高又经过切割等程序，导致汁液流失严重，这些受伤的组织为微生物提供营养，使多种微生物群落得以繁殖，导致腐败，这直接限制了产品流通和货架期，腐败菌对鲜切蔬菜产生破坏的症状主要体现在褐变、产生异味、结构丧失以及在较低程度上的软腐，这极大地影响到消费者的购买欲望。

在鲜切蔬菜的贮藏过程中，肠杆菌、假单胞菌以及乳酸菌等腐败菌的增长与酸味、褐变、软腐有很强的相关性，研究鲜切蔬菜中特定腐败菌的情况，将会对选择适宜的保鲜方式起到重要的指导作用，但目前尚缺少有效的检测方法。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种能够有效测定鲜切叶菜菌群的方法。

为实现上述目，本发明提供了一种鲜切叶菜菌群测定方法，包括以下步骤：

步骤A：对蔬菜进行清洗，然后使用经灭菌处理的刀具，将蔬菜根部切割去除；在无菌条件下对去除根部后的蔬菜进行随机分装，放入无菌托盘，并用无菌PE保鲜膜包好，置于4℃下贮藏；

步骤B：在无菌条件下，从贮藏的蔬菜中选取不同部位的叶片共10g，置于无菌均质袋中，加入90mL质量浓度为8.5g/L的无菌生理盐水，在无菌均质仪以8次/秒的频率均质1min，静置10min，在高速冷冻离心机中以10000r/min的速度离心10min，弃上清，取10mL沉淀，置于-80℃冻存；使用DNA提取试剂盒从上述沉淀中提取细菌基因组DNA，并用1％琼脂糖凝胶电泳检测效果；

步骤C：以上述提取的细菌基因组DNA为模板，引物针对16SrRNA基因V3-V4区合成特异引物，利用341F：CCTACGGGNGGCWGCAG；805R： GACTACHVGGGTATCTAATCC；引物进行PCR扩增，扩增后的PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测效果；定量量取回收的DNA，加入DNA稀释液，得到浓度为20pmol的混合样品；对混合样品进行高通量测序；

步骤D：根据高通量测序结果，进行数据质控及过滤，包括：去除引物接头序列、序列拼接、质量剪切、去除非扩增区域序列和嵌合体序列，随后进行blastn比对，在97％的相似水平下进行归类得到分类操作单元，以此得出每个分类操作单元的分类学信息；基于得到的各个分类操作单元，计算香农指数、菌种丰富度指数、辛普森指数、覆盖率指数和ACE指数，衡量样品中菌种的多样性，并且通过贝叶斯算法对97％相似水平的分类操作单元的代表序列进行分类学分析，在科、属水平上进行群落丰度统计分析并作图，得到微生物群落结构组成，鉴定优势腐败菌；

其中所述步骤B和步骤C以天为单位重复若干次。

本发明提供的鲜切叶菜菌群测定方法，能够有效检测鲜切叶菜在不同贮藏时期的菌群变化，为鲜切叶菜的防腐杀菌与贮运等提供重要的依据。

具体实施方式

下面以具体实施例为例，详细说明本发明的实施方式。

本实施例以鲜切叶菜中的鲜切菠菜为例，进行鲜切菠菜菌群变化的测定，包括以下步骤：