[发明专利]具有双层不同内部孔径结构的蛋白基水凝胶及其制备方法

说明书

本发明公开具有双层不同内部孔径结构的蛋白基水凝胶及其制备方法，本发明采用冷冻凝胶法制备蛋白基双层水凝胶，其制备原理为以含羧基的水溶性高分子为交联剂，通过蛋白中的氨基与交联剂的羧基之间的酰胺反应，在低温下制备具有双层不同内部孔径结构的蛋白基水凝胶。本发明所涉及的双层水凝胶以富血小板裂解液血浆为主要基质，具有独特的双层不同内部孔径结构和高孔隙率，而且制备方法简单，制备条件为低温环境，因而有利于富血小板裂解液血浆中蛋白等生物活性分子的保存。另一方面，双层水凝胶的小孔凝胶层在密实程度及硬度上比大孔凝胶层要强，因而其在具有软硬两层不同结构组织的损伤修复等领域具有重要的应用前景。

技术领域

本发明属于生物材料技术领域，具体涉及一种具有双层不同内部孔径结构的蛋白基水凝胶及其制备方法。

背景技术

水凝胶因其内部为三维微孔结构,不仅有利于细胞在凝胶内部的铺展、迁移与增殖，还便于营养物质与代谢产物的吸收与排泄，因而在生物医学领域包括细胞培养、组织再生等方面具有广泛的应用前景。

然而，一些组织的损伤(如牙周炎)不仅浅层有破损，还累及到了深层，且浅层和深层组织的结构及致密程度不同[Hajishengallis G.Nature Reviews Immunology,2015,15(1):30-44.]，这就造成了水凝胶的内部微孔结构及本身的密实程度不能很好地与组织缺损部位的结构相适应。

为了解决这一问题，具有不同内部微孔结构的双层水凝胶成为了研究的热点。目前已经制得的双层水凝胶基本上是通过非共价键的方式(如氢键)结合在一起[参考文献Tavakoli J,Mirzaei S,Tang Y.Polymers,2018,10(3):305.]，通过这些方法制得的双层水凝胶两层凝胶之间结合得并不牢固，在加热、剪切力等因素下两层凝胶很容易分开。因此，制备一种以蛋白组分为基质、共价键连接的双层水凝胶，并且双层凝胶具有不同内部孔径结构，对于多层结构组织的损伤修复具有重要的应用价值，并且迄今为止尚未见报道。

发明内容

本发明的目的是为了克服现有技术存在的缺点和不足，而提供一种具有双层不同内部孔径结构的蛋白基水凝胶的制备方法。

为实现本发明的上述目的，本发明的第一方面提供了具有双层不同内部孔径结构的蛋白基水凝胶，其技术方案是以含羧基的水溶性高分子为交联剂，通过蛋白中的氨基与交联剂的羧基之间的酰胺反应，在低温下制备具有第一孔隙的蛋白基第一水凝胶层，然后在蛋白基第一水凝胶层上再次通过酰胺反应制备具有第二孔隙的蛋白基第二水凝胶层，两层水凝胶层通过化学键结合在一起，所述的第一孔隙和第二孔隙不等设置。

进一步设置是蛋白组分的质量百分比超过90％，孔隙率大于50％，两层水凝胶的内部孔径30微米-200微米。

本发明还提供一种蛋白基水凝胶的制备方法，包括有以下步骤：

(1)制备蛋白基第一水凝胶层，以富血小板裂解液血浆冻干粉、交联剂、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺和磷酸缓冲盐溶液为原料，通过酰胺反应制备蛋白基第一水凝胶层；

(2)采用与步骤(1)相同的原料，并改变富血小板裂解液血浆冻干粉和交联剂之间的质量比例，在蛋白基第一水凝胶层表面通过酰胺反应叠加制备蛋白基第二水凝胶层，蛋白基第一水凝胶层的内部孔隙与蛋白基第二水凝胶层的内部孔隙的孔径不等设置。

进一步设置是所述的富血小板裂解液血浆冻干粉通过以下步骤制备：

a1.将采集的血液在1000-2000转/分钟的转速下离心，再在2800-3200转/分钟的转速下二次离心，收集上层淡黄色液体去除下层红细胞溶液；

a2.通过液氮将所述淡黄色液体快速冷冻，再在37℃水浴中融解，反复操作3-5次；