[发明专利]用于检测EGFR突变的组合物、试剂盒和方法

说明书

本发明公开用于检测EGFR突变的组合物、试剂盒和方法。组合物包含正向引物、反向引物和野生型EGFR基因结合分子，且正向引物和反向引物的组合能够得到包含EGFR突变位置的扩增产物。正向引物包括5’端区域、3’端区域和中间区域，5’端区域的两侧序列能够进行互补形成茎环结构，在5’端区域的第一末端具有荧光基团和第二末端具有淬灭基团，3’端区域的3’端最后一个碱基与待检测的突变碱基互补。反向引物包括位于5’端的标签序列和能够与待检测的突变位置的下游部分序列完全互补的结合区域。野生型EGFR基因结合分子设置为能够特异性识别并结合至野生型EGFR基因的待测突变位置。提高了EGFR检测的灵敏度和特异性。

技术领域

本发明涉及基因检测，具体涉及用于检测EGFR突变的组合物、试剂盒和方法。

背景技术

随着转化医学的飞速发展，晚期非小细胞肺癌(NSCLC)患者的治疗已从化疗时代转向分子靶向治疗时代，其中表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)是最重要的肺癌驱动基因，EGFR-TKIs是针对此靶点的小分子抑制剂，EGFR基因活化突变的晚期NSCLC患者能从EGFR-TKI显著获益。然而，几乎所有服用EGFR-TKI的患者最终将出现耐药，早期研究发现，约50％耐药的患者具有EGFR 20号外显子第790位密码子错义突变(即T790M突变)，并且与EGFR-TKI疗效密切相关，如何敏感、准确地检测T790M基因突变成为关注热点及技术关键。

一直以来，直接测序法是EGFR突变的标准检测方法，但其过程稍繁琐、耗时长，检测10％以下突变率的样本常常出现假阴性。虽然目前还存在其他检测方法，但均存在许多问题。例如，虽然普通的ARMS法灵敏度可达1％左右，但尚不能检测更低突变频率的样本。ddPCR法可对T790M突变进行定量检测，灵敏度可达0.4％甚至更高，但耗材昂贵，操作复杂。NGS是边合成边测序技术(Sequencing by Synthesis,SBS)，高通量高深度，价格昂贵，适用于多基因多位点检测，不适合少量位点的检测。

发明内容

为解决现有技术中的至少部分技术问题，本发明提供一种用于检测EGFR突变的新方案。具体地，本发明包括以下内容。

本发明的第一方面，提供一种用于检测EGFR突变的组合物，其包含正向引物、反向引物和野生型EGFR基因结合分子，且所述正向引物和所述反向引物的组合能够得到包含EGFR突变位置的扩增产物，其中：

所述正向引物包括5’端区域、3’端区域和位于所述5’端区域和所述3’端区域之间的中间区域，所述5’端区域包括第一侧序列、第二侧序列以及两者之间的环序列，且第一侧序列和第二侧序列能够进行第一互补，从而形成茎环结构，在所述5’端区域的第一末端具有荧光基团和第二末端具有淬灭基团，所述3’端区域的3’端最后一个碱基与待检测的突变碱基互补，所述中间区域设置为使所述5’端区域和所述3’端区域相对分开；

所述反向引物包括位于5’端的标签序列和能够与待检测突变的下游的一部分序列完全互补的结合区域；和

所述野生型EGFR基因结合分子设置为能够特异性识别并结合至野生型EGFR基因的待测突变位置。

在某些实施方案中，所述正向引物设置为其至少部分序列能够与所述扩增产物的部分序列进行第二互补，且第二互补区的Tm值大于第一互补区的Tm值。

在某些实施方案中，从所述3’端区域的3’端起倒数第2-6个碱基位引入至少一个错配碱基，优选引入一个错配碱基。

在某些实施方案中，所述中间区域的结构为(CH₂)m，其中m为5-20之间的自然数。

在某些实施方案中，所述标签序列的长度为5-20nt，且所述标签序列与待检测的EGFR的序列不互补。