[发明专利]一种制备牙髓干细胞的方法

说明书

本发明提供了一种制备牙髓干细胞的方法，包括以下步骤：S1、牙齿的采集；S2、分离牙髓干细胞，固定住牙齿，劈开牙冠，取出牙髓，将取出的牙髓放入PBS中冲洗，然后将取出的牙髓制成1‑3mm³的块状，加入0.025%‑0.2%的Ⅰ型胶原酶和0.025%‑0.2%的中性蛋白酶的混合液，37℃消化10min‑30min，加入PBS，1000rpm‑1500rpm离心弃上清，沉淀加入培养基浸润，将组织块贴到细胞培养皿中，置CO₂培养箱中培养。由于采用了上述技术方案，与现有技术相比，本发明的优点是：提供的消化贴壁法所用的酶为Ⅰ型胶原酶和中性蛋白酶的混合物，Ⅰ型胶原酶与中性蛋白酶的作用都比较温和，既可以降低周围组织对干细胞的禁锢，又不会对细胞造成损伤，即保证了分离干细胞的纯度，又缩短了收获细胞所需的时间。

技术领域

本发明涉及细胞生物学领域。

具体地说，是涉及一种制备牙髓干细胞的方法。

背景技术

牙髓干细胞(DPSCs)属于多能成体干细胞，并且具有分化为神经细胞、成骨细胞、脂肪细胞和成软骨细胞的潜能。研究表明，牙髓干细胞能够用于牙本质、牙髓、牙体组织的修复与再生，还可用于颅骨、颌骨及面骨的损伤修复，牙髓干细胞在其他疾病方面的应用研究也很多，例如：牙髓干细胞可用于治疗脑血管意外损伤、脊髓损伤、帕金森氏病、心肌梗死、糖尿病和免疫缺陷性等疾病。

由于人口腔中细菌和真菌的种类繁多、数量巨大，牙髓干细胞在制备过程中极易污染，通常会通过加大抗生素的用量或提高抗生素等级来降低污染几率，从而导致抗生素滥用。而且组织贴壁法培养牙髓干细胞，周期较长。因此，在牙髓干细胞制备过程中防止抗生素滥用、提高分离牙髓干细胞的效率、缩短生长周期，是本领域亟待解决的问题。

发明内容

本发明的目的在于克服上述传统技术的不足之处，提供一种制备牙髓干细胞的改良法。该方法既有效降低细菌和真菌对牙髓干细胞的污染，又避免了抗生素滥用，而且对人体无毒无害。此外，牙髓采用先消化后贴壁的提取方法，且培养初期添加干细胞生长因子，有效促进牙髓干细胞生长，缩短获得牙髓干细胞的时间。

本发明的目的是通过以下技术措施来达到的：

一种制备牙髓干细胞的方法，包括以下步骤：

S1、牙齿的采集；

S2、分离牙髓干细胞，固定住牙齿，劈开牙冠，取出牙髓，将取出的牙髓放入PBS中冲洗，然后将取出的牙髓制成1-3mm³的块状，加入0.025%-0.2%的Ⅰ型胶原酶和0.025%-0.2%的中性蛋白酶的混合液，37℃消化10min-30min，加入PBS，1000rpm-1500rpm离心弃上清，沉淀加入培养基浸润，将组织块贴到细胞培养皿中，置CO₂培养箱中培养。

作为一种改进：在步骤S2中，培养皿中组织块与组织块间隔4-5mm，每块组织上滴培养基，所述CO₂培养箱内饱和湿度，5%CO₂，37℃。

作为一种改进：还包括以下步骤：

S3、后期培养，4-6h后补加培养基，第3-5天继续补加培养基，第7-9天半量换液，第10-15天显微镜下观察细胞克隆情况，若细胞形态均一且数量符合预定值，需弃组织块全换液，若细胞数量不符合预定值，需继续半量换液至细胞数量符合预定值，方可弃组织块全换液，此后每2-3天换液一次。

作为一种改进：在步骤S1中，采集后牙齿置于运输液中保存和运输，所述运输液包括以下组分：

抗菌肽 10-30ug/ml；

猪胆盐 0.3-0.8mg/ml；

氯化两面针碱 1-10ug/ml；