[发明专利]一株过表达三磷酸腺苷酶的谷氨酸棒杆菌及其构建方法与应用

说明书

本发明公开了一株过表达三磷酸腺苷酶的谷氨酸棒杆菌，所述三磷酸腺苷酶的基因序列如SEQ ID NO:1所示。本发明通过在谷氨酸棒杆菌中过表达三磷酸腺苷酶ATPase，为中间转换蛋白VirB11提供能量，促使菌毛脱落形成Ⅳ型分泌通路，增加胞外DNA分泌量，提升细菌的初始粘附能力，提高生物膜结构的稳定性。

技术领域

本发明涉及一株过表达三磷酸腺苷酶的谷氨酸棒杆菌及其构建方法与应用，属于生物技术领域。

背景技术

生物被膜又被称为生物膜，是细菌为在环境中更好生长和繁殖的生存形式。生物膜的形成分为四个阶段：吸附，增值，成熟和分散，分散出来的细胞再次进入第一个阶段如此以往的循环，其中吸附时期分为可逆与不可逆阶段。在生物膜形成过程中细胞分泌出胞外物质，其中主要成分为蛋白，多聚糖，eDNA，这些化学成分聚合为致密的包涵体，从而促使了生物膜的形成。以往的研究表明蛋白作为支柱支撑着生物膜空间结构，多糖作为粘合剂充实整个空间，但最新研究表明eDNA是生物膜的灵魂主宰，并且从生物膜初始阶段就参与整个形成过程，无论是从时空上还是空间上，eDNA都无处不在。

已经有研究表明eDNA可以增加菌体初始对载体以及菌体自身之间的粘附，从而促使生物膜的后期形成，并且可以稳固生物膜的结构。生物膜的形成从第一批细胞到载体上就已经开始了，细胞开始分泌出DNA，DNA作为一种载体与细胞之间的粘合剂使得细胞与载体之间无法分开，接着以相同的方法拉近细胞与细胞之间的距离。随后细胞便会分泌出多糖和蛋白用来巩固DNA形成的网状结构，使生物膜不易被破坏。这三样胞外分泌物质是生物膜形成过程中不可缺少的。胞外DNA的增加有多种方法，如外源加入DNA，去除细胞本身分泌的胞外核酸酶，促进细胞分泌DNA，增加胞外多糖也可以从另一方面使eDNA增多。Ⅳ型分泌系统在革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌中均有发现，它们的分泌底物范围很广，例如蛋白质及核糖核蛋白复合物等大分子物质还可以有效地分泌出DNA。我利用这个特点增加胞外DNA含量，通过过表达Ⅳ型分泌系统蛋白从而促使DNA的分泌使得成膜效果增强。原始的谷氨酸棒状杆菌形成生物膜的效果不理想，但它作为产氨基酸的重要菌株，我们需要对这株菌进行分子改造，使其成膜效果增强，后期连续化发酵才有所效果。

固定化细胞连续发酵技术现如今已经投入到生产当中，其中用生物膜的方式进行固定化连续发酵已初见成效。

了解和阐明eDNA对生物膜的重要作用有助于我们运用到谷氨酸棒状杆菌上，弄清eDNA与生物膜中其他胞外分泌物的关系可以为我们筛选改造谷氨酸棒状杆菌的基因，以此来促进谷氨酸棒状杆菌生物膜的形成，并为固定化发酵提高产量提供基础。

发明内容

本发明要解决的技术问题是，提供一株过表达三磷酸腺苷酶的谷氨酸棒杆菌以解决现有技术中谷氨酸棒杆菌成膜能力弱，不能用于连续化发酵的问题。

本发明还要解决的技术问题是，提供上述过表达三磷酸腺苷酶的谷氨酸棒杆菌的构建方法。

本发明最后要解决的技术问题是，提供上述过表达三磷酸腺苷酶的谷氨酸棒杆菌在发酵制备脯氨酸中的应用。

一株过表达三磷酸腺苷酶的谷氨酸棒杆菌，该菌株中过表达三磷酸腺苷酶。

Ⅳ型分泌通路的形成是由于鞭毛脱落造成的，在细胞内通过VirB11将胞内的VirB4转换成VirD4，即可将胞外的菌毛脱落从而形成可将DNA分泌出去的通路，而本发明过表达的三磷酸腺苷就是为中间转换蛋白VirB11提供能量，从而促使菌毛脱落形成Ⅳ型分泌通路。

其中，所述谷氨酸棒杆菌为谷氨酸棒状杆菌ATCC13032。

其中，所述三磷酸腺苷酶的基因序列如SEQ ID NO:1所示。

上述过表达三磷酸腺苷酶的谷氨酸棒杆菌的构建方法，包括如下步骤：

(1)将SEQ ID NO:1所示核苷酸序列克隆到质粒上，得到重组质粒；