[发明专利]抗大黄鱼IgM单克隆抗体及其制备方法

说明书

抗大黄鱼IgM单克隆抗体及其制备方法。抗大黄鱼IgM单克隆抗体为杂交瘤细胞株IgM‑9G7。制备大黄鱼IgM抗原；制备杂交瘤细胞株IgM‑9G7；制备抗大黄鱼IgM的单克隆抗体。大黄鱼IgM单克隆抗体是由杂交瘤细胞株IgM‑9G7产生、对大黄鱼IgM具有特异性的抗体。该细胞分泌的免疫球蛋白能够高效特异性结合大黄鱼IgM，最高效价达到2×10⁴。将纯化的大黄鱼IgM免疫动物，取其产生抗大黄鱼IgM单克隆抗体的脾细胞与骨髓瘤细胞融合获得能够分泌特异性抗体的杂交瘤细胞株，该细胞株能分泌抗大黄鱼IgM的单克隆抗体。此抗体特异性高，灵敏度高，可用于大黄鱼IgM的结构分析、免疫应答水平检测等。

技术领域

本发明涉及单克隆抗体及其制备方法，尤其是涉及一种抗大黄鱼(Larimichthyscrocea)IgM的单克隆抗体及其制备方法。

背景技术

我国是世界第一水产养殖大国。随着水产养殖规模的不断扩大及养殖种类的多样化，养殖病害防治问题日益突出，成为水产科研工作者的研究重点。从鱼类自身的免疫能力出发来研究其抵御疾病侵袭的机理，不仅有助于认识脊椎动物免疫系统的进化规律及特点，而且有助于促进鱼类疫苗的研制和发展。鱼类是最早出现免疫球蛋白的生物，虽然与哺乳动物的免疫系统相比还比较原始，但是已经形成包括非特异性免疫反应、细胞免疫、体液免疫等比较完善的免疫应答系统。

免疫球蛋白(Immunoglobulin,Ig)是鱼类特异性免疫中关键的分子。IgM是B淋巴细胞表面分子标志，目前在大黄鱼血清中仅发现了IgM一种大黄鱼免疫球蛋白，其重链约74kD，轻链约25kD([1]韩一凡.溶藻弧菌外膜蛋白DNA重组表达载体的构建及兔抗大黄鱼IgM血清制备[D]；中国海洋大学,2006)。借助高质量的抗大黄鱼IgM单克隆抗体，可进行大黄鱼IgM⁺B淋巴细胞分选，将为大黄鱼B淋巴细胞的功能及相关免疫学机制研究提供帮助。此外，鱼类感染病原或接种疫苗后，鱼体产生的针对该抗原的特异性抗体，也可以通过该单克隆抗体进行特异性抗体效价检测([2]ZHANG Y A,SALINAS I,LI J,et al.IgT,aprimitive immunoglobulin class specialized in mucosal immunity[J].NatureImmunology,2010,11(9):827)。因此，利用抗大黄鱼IgM单克隆抗体，通过检测大黄鱼血清中该特异性IgM的效价，可进行大黄鱼疾病的诊断和疫苗使用效果的评价，对大黄鱼疾病的研究及防治具有重要理论和现实意义。

发明内容

本发明的目的在于为了解决利用单克隆抗体研究大黄鱼免疫球蛋白结构与功能，将单克隆抗体用于大黄鱼病原微生物检测，协助鱼病诊断与防治等，提供抗大黄鱼IgM单克隆抗体及其制备方法。

所述抗大黄鱼IgM单克隆抗体为杂交瘤细胞株IgM-9G7，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏地址为武汉武汉大学，保藏中心保藏编号为CCTCC NO：C2018104，保藏日期为2018年05月15日。

所述大黄鱼IgM单克隆抗体的制备方法包括以下步骤：

1)制备大黄鱼IgM抗原；

在步骤1)中，所述制备大黄鱼IgM抗原的具体方法可为：将大黄鱼麻醉，进行尾部取血，采血后凝固，放置，待血清充分析出后，离心取上层血清，将血清与PBS稀释，过滤后使用蛋白A亲和柱和分子筛得到大黄鱼血清中的IgM抗原，该IgM抗原蛋白包括重链和轻链，所述重链为76kD，所述轻链为25kD；所述大黄鱼麻醉可采用MS-222麻醉剂麻醉；所述尾部取血可采用2mL医用注射器；所述凝固可在室温下凝固1h；所述放置可于4℃放置12h；所述离心的条件可为3000g，5min；所述将血清与PBS稀释可将血清与pH值为8的PBS等比稀释；所述过滤可采用0.45μm滤膜过滤，所述滤膜与蛋白A亲和柱、分子筛均为业内常用工具；所得到的大黄鱼血清中的IgM抗原为高纯度的大黄鱼血清IgM。

2)制备杂交瘤细胞株IgM-9G7；