[发明专利]一种tDNA-FITC+CD@CaL+AF660比率荧光探针及其制备方法和应用

权利要求书

1.一种tDNA-FITC+CD@CaL+AF660比率荧光探针的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：

(A)钙离子响应探针CD@CaL的制备：

(i)将对苯二胺溶于溶剂，转移到高压反应釜中高温反应，然后透析纯化，获得碳点；

(ii)随后将钙离子配体与步骤(i)合成的碳点在溶剂中混合，进行席夫碱反应，获得钙离子响应探针CD@CaL；

(B)tDNA-FITC+CD@CaL+AF660比率荧光探针的制备：首先将荧光素FITC修饰的DNA、Alexa Fluor 660 AF660修饰的DNA、醛基-CHO修饰的DNA以及组成四面体的第四条DNA粉末离心，让DNA粉末沉入管底，然后加入磷酸盐缓冲液溶解DNA粉末，随后混合、退火，然后冷却获得DNA四面体，然后加入钙离子响应探针CD@CaL，进行席夫碱反应，获得所述tDNA-FITC+CD@CaL+AF660比率荧光探针。

2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(i)在高温反应之后，还包括对反应产物进行冷却，然后在乙醇中用透析袋透析的步骤。

3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(i)中，所述溶剂为乙醇；所述高温反应的温度为250-300℃；所述高温反应的时间为3-6h。

4.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述透析袋的分子量为100-500Da。

5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(i)中，所述对苯二胺与溶剂的质量/体积比为(0.1-0.5g)：(30-50ml)。

6.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(ii)在席夫碱反应之后，还包括旋蒸去除溶剂，并在乙醇中用透析袋透析的步骤。

7.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(ii)中，所述溶剂为CH₂Cl₂、乙醇、甲醇；所述席夫碱反应的温度为20-25℃；所述席夫碱反应的时间为10-24h。

8.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(ii)中，所述钙离子配体与碳点的摩尔/质量比为(1-5mmol)：(20-40mg)。

9.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述透析袋的分子量为1000-1500Da；所述透析的时间为10-20h；所述旋蒸的温度为25-40℃。

10.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(B)中，所述离心的条件为3000-5000rpm离心3-5min；所述退火的温度为93-95℃；所述退火的时间为5-10min。

11.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(B)中，所述钙离子响应探针CD@CaL与DNA的浓度比为(0.2-0.5mg/ml)：(0.1-0.2mM)。

12.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(B)中，所述荧光素FITC修饰的DNA的序列如SEQ ID NO.1所示；所述Alexa Fluor 660 AF660修饰的DNA的序列如SEQ ID NO.2所示；所述醛基-CHO修饰的DNA的序列如SEQ ID NO.3所示；所述组成四面体的第四条DNA的序列如SEQ ID NO.4所示。

13.如权利要求1-12之任一项所述的制备方法制备得到的钙离子响应探针CD@CaL或tDNA-FITC+CD@CaL+AF660比率荧光探针。

14.如权利要求13所述的钙离子响应探针CD@CaL或tDNA-FITC+CD@CaL+AF660比率荧光探针在检测pH或Ca²⁺中的应用。

15.如权利要求13所述的钙离子响应探针CD@CaL或tDNA-FITC+CD@CaL+AF660比率荧光探针在同时检测pH和Ca²⁺中的应用。