[发明专利]一种植物植原体基因组的测序方法

权利要求书

1.一种植物植原体基因组的测序方法，其特征在于，包含以下步骤：

(1)获取富含植原体的白花泡桐组织培养幼苗茎

在培养基上培养含有植原体的泡桐丛枝幼苗，每天25-29℃、130μmol·m^-2s^-1光照，14-18小时周期条件下培养28-32天，后收获幼苗的嫩茎段， 在液氮中冷冻后，储存在-80℃冰箱；

(2)白花泡桐和植原体基因组的DNA混合物分离提取；

采用CTAB法提取白花泡桐和植原体的混合基因组DNA，并在OD260/280和OD260/230的吸光度值下评估DNA样品的纯度，并检测DNA的完整性，最后纯化DNA样品，并将DNA保存在-80℃以备后用；

(3)白花泡桐和植原体基因组的DNA混合物测序；

用g-TUBE中断富含所述植原体的白花泡桐基因组DNA，并富集和纯化DNA片段，然后对片段化的DNA进行损伤修复和末端修复；

采用连接酶将DNA片段两端与接头连接；未能连接的DNA片段用外切酶切除，然后对连接产物进行纯化，同时对文库进行评估，最后将DNA模板和酶的混合物，进行实时单分子测序；

(4)植原体基因组测序数据的处理、统计和组装；

在测序数据中去除接头和低质量读长得到高质量读长，同时去除与寄主泡桐相似的读长；

然后将高质量读长进行组装，先将长读长用作种子纠正短读长，其中大于8366bp的读长作为长读长，小于8366bp的读长作为短读长，再对用作种子的高质量读长进行组装；最后，将原始数据与组装的参考序列进行比对，并对组装后的结果进行优化和校正；

进行测序深度分析，去掉覆盖深度低于100.00X的低深度重叠群，连接其余的重叠群；组装后， 将原始数据与组装的参考序列比对，计算参考序列的覆盖深度和百分比；

(5)对白花泡桐和植原体的转录组进行测序，验证基因组的可靠性；

步骤（4）中，所述低质量读长为：除接头外，未知碱基比例大于10％的读长和质量值小于10的碱基数占整条读长的50％以上读长。

2.根据权利要求1所述的一种植物植原体基因组的测序方法，其特征在于，步骤(2)中，CTAB法提取泡桐丛枝和植原体的混合基因组DNA的方法为：将样品研磨成粉末，吸取65℃预热的CTAB 1000μL加入含有0.1-0.2g研磨好的样品的离心管中，充分混合，再加入等体积的溶液混合物一充分混合后离心；吸出液体上清液再加入等体积的溶液混合物二，充分混匀后离心；再吸出液体上清液，加入1/10体积3mol/L的NaAc，pH5.2和2.5倍体积的无水乙醇轻轻搅拌均匀；离心后弃去液体上清液；加入70％乙醇，冲洗DNA沉淀物，然后离心弃去上清液；最后将DNA干燥后加入无菌双蒸水再加入RNAase，37℃，保持30分钟；

所述溶液混合物一为：体积比分别为25：24：1的苯酚、氯仿和异戊醇混合物；

所述溶液混合物二为：体积比分别为24：1的氯仿与异戊醇混合液。

3.根据权利要求1所述的一种植物植原体基因组的测序方法，其特征在于，步骤(4)中，对所述高质量种子读长组装的方法为：对所述高质量种子读长，采用OLC assemblyalgorithm软件进行组装。