[发明专利]一种类角膜上皮细胞、组织工程化角膜上皮及制备与应用

权利要求书

1.一种类角膜上皮细胞的制备方法，其特征在于包含如下步骤：

（1）以人或哺乳动物皮肤表皮细胞为种子细胞，采用含终浓度为30～50μg/mL EGF和20～30ng/mL LIF的无血清培养基诱导培养10～24h，使表皮细胞去分化、回到较原始的状态，得到去分化的表皮细胞；

（2）将步骤（1）制得的去分化的表皮细胞与人或哺乳动物角膜基质成纤维细胞采用transwell共培养系统进行共培养，培养3～5天，使皮肤表皮细胞向角膜上皮细胞分化，得到类角膜上皮细胞。

2.根据权利要求1所述的类角膜上皮细胞的制备方法，其特征在于：

步骤（1）中所述的含终浓度为30～50μg/mL EGF和20～30ng/mL LIF的无血清培养基的组分为：F12+1～1.2%BSA+30～50ng/mL EGF+20～30ng/mL LIF+100U/mL青链霉素+100μg/mL链霉素。

3.根据权利要求1所述的类角膜上皮细胞的制备方法，其特征在于：

步骤（1）中所述的诱导培养的时间为20～24h。

4.一种类角膜上皮细胞，其特征在于通过权利要求1～3任一项所述的制备方法制备得到。

5.权利要求4所述的类角膜上皮细胞在制备移植、修复、重建角膜缘干细胞缺损产品中的应用。

6.一种组织工程化角膜上皮，其特征在于由权利要求5所述的类角膜上皮细胞构建得到。

7.权利要求6所述的组织工程化角膜上皮的制备方法，其特征在于包含如下步骤：

将上述类角膜上皮细胞接种至去上皮细胞的人羊膜支架上，用无血清培养基培养，第1～5天为浸没培养，随后进行气-液界面培养；培养14～16天后，得到组织工程化角膜上皮。

8.根据权利要求7所述的组织工程化角膜上皮的制备方法，其特征在于：

所述的无血清培养基包含如下组分：F12+1～1.2%BSA+20～25ng/mL EGF+2.5μg/mLinsulin+10～15ng/mL IGF-1+0.4～0.6μg/mL氢化可的松+100U/mL青链霉素+100μg/mL链霉素。

9.根据权利要求7所述的组织工程化角膜上皮的制备方法，其特征在于：

所述的去上皮细胞的人羊膜支架的制备方法，包含如下步骤：

（1）无菌条件下，将带有羊膜的胎膜囊放入含有青霉素、链霉素的生理盐水中，顿性剥离附着在胎膜囊上的羊膜；

（2）将剥离下的羊膜分别用生理盐水和含青霉素、链霉素的PBS冲洗，然后顿性剥离海绵层；

（3）将去除海绵层的羊膜采用PBS冲洗，然后加入含0.1～0.4wt%胰酶和0.05～0.2wt%EDTA的消化液，经8～24h消化去除上皮细胞；

（4）将去除上皮细胞的羊膜基底面向上平铺，将醋酸纤维素膜剪成中空的支架附于其上，然后翻转，使其羊膜上皮面向上，然后36～38℃放置30～120min，得到去上皮细胞的人羊膜支架。

10.权利要求6所述的组织工程化角膜上皮在制备移植、修复、重建角膜缘干细胞缺损产品中的应用。