[发明专利]CrpM

说明书

本发明公开了Crp^M基因在提高葡糖杆菌属菌株的DHA胁迫耐受性中的应用，Crp^M基因为G.frateurii HD924环腺苷酸受体蛋白编码基因Crp突变体，该基因第211个碱基C突变为G，相应编码的第71个氨基酸Leu突变为Asp；第242个碱基A突变为C，相应编码的第81个氨基酸Leu突变为Asp，Crp^M基因的序列如SEQ ID NO：02所示；通过Crp^M基因对葡糖杆菌属菌种进行改造，可显著提升了DHA生产菌种对产物的耐受性，能够有效的提升甘油转化效率、增强DHA的生产强度、简化生产工艺、减少设备的投入、降低生产成本。

技术领域

本发明涉及生物工程和基因工程技术领域，具体涉及Crp^M基因及Crp^M操纵子在提高葡糖 杆菌属菌株的DHA胁迫耐受性中的应用。

背景技术

1,3-二羟基丙酮(1,3-Dihydroxyacetone，DHA)是最简单的酮糖，外观是白色粉末状结 晶，有甜味，易溶于水、乙醇、丙酮和乙醚等溶剂，是一种重要的精细化工产品，可作为农 药合成中间体、精细化工原料和医药前体，用途广泛且使用量大。二羟基丙酮的工业化生产 主要是利用能够合成高活性甘油脱氢酶的微生物以甘油为底物发酵生产。目前报道最多的微 生物为葡糖杆菌属(Gluconobacter)，如Gluconobacter oxydans、Gluconobacter frateurii、 Gluconobacter melanogenus等菌种，葡糖杆菌属生产性能稳定，甘油生成DHA的转化率高， DHA产量可以达到150g/L以上，是工业发酵上常用的菌株。

在DHA发酵过程中，当产物DHA的积累到一定量时会抑制葡糖杆菌属菌株的生长，造成 菌体生长停止。DHA产物的抑制作用属于反馈抑制，据报道，基于DHA反馈抑制动力学和死 亡率动力学模型分析，当DHA浓度达到61g/L时菌体停止生长，当DHA浓度达到108g/L时甘油停止转化。当DHA浓度过高时葡糖杆菌属菌株细胞受到不可逆的损伤，DHA对磷酸戊糖循环也有抑制作用。产物的抑制作用限制了高生产强度发酵生产DHA，研究发现，解决底物和产物的抑制作用一般是优化发酵工艺，如通过复杂的半连续两阶段反复补料发酵、固定 化细胞、静息细胞转化来消除产物的抑制效果。上述工艺虽然能在一定程度上消除产物的抑 制效果，但是会增加设备投入，造成生产工艺冗长，增加发酵成本。

通过对菌种的理性设计改造，提升DHA生产菌种对产物的耐受性，是解决DHA产物抑制 效果的有效策略之一。由于DHA对葡糖杆菌属菌株的生长抑制机制复杂，目前尚未有解析该 机制的报道。因此，通过理性改造葡糖杆菌属菌株提高其对DHA的耐受性存在技术障碍。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有技术中由于DHA对葡糖杆菌属菌株的生长抑制机制 复杂，尚缺少提升DHA生产菌种对产物的耐受性的有效策略的缺陷，通过在葡糖杆菌属如： Gluconobacter oxydans、Gluconobacter frateurii、Gluconobactermelanogenus等菌株 中过量表达Crp突变体，能够显著提高葡糖杆菌属对1,3-二羟基丙酮的耐受性，显著增强 1,3-二羟基丙酮的产量及生产强度。

为了解决上述技术问题，本发明提供了如下的技术方案：

申请人发现G.frateurii HD924环腺苷酸受体蛋白(cyclic amp receptorprotein) 编码基因Crp的第211个碱基C突变为G，相应编码的第71个氨基酸Leu突变为Asp；第242 个碱基A突变为C，相应编码的第81个氨基酸Leu突变为Asp后获得的突变体Crp^M基因能够 显著提高葡糖杆菌属对1,3-二羟基丙酮的耐受性，显著增强1,3-二羟基丙酮的产量及生产 强度。

Crp的基因如SEQ ID NO：01所示，Crp^M基因的序列如SEQ ID NO：02所示。