[发明专利]一种基于实时荧光PCR检测短短芽孢杆菌的引物和探针、试剂及其试剂盒与方法

说明书

本发明公开了一种基于实时荧光PCR检测短短芽孢杆菌的引物和探针、试剂及其试剂盒与方法，其中，提供的引物和探针，具有良好的灵敏性和特异性，通过实时荧光PCR方法可以定性分析环境污染降解菌剂中是否含有短短芽孢杆菌，发挥了实时荧光PCR检测技术中结果的可靠性高、灵敏度好、特异性强、操作简单快捷等优点，进一步完善了环境污染降解菌剂检测体系，加大对国际技术贸易壁垒的保护力度。

技术领域

本发明公开涉及实时荧光PCR检测的技术领域，尤其涉及一种基于实时荧光PCR检测短短芽孢杆菌的引物和探针、试剂及其试剂盒与方法。

背景技术

随着人类对环境生态的保护意识日益提高，环境污染降解菌剂在环境保护、污水净化等方面的应用越来越广。目前，国内外应用于检测环境污染降解菌剂菌种技术主要有三种：形态学生理生化方法、PCR特异性扩增法、基因序列测定比对法，在实际检测中应用最多的是形态学生理生化方法和PCR特异性扩增法，PCR特异扩增法又有普通定性PCR、实时荧光PCR、巢式PCR等。

近年来，我国每年从美国、日本等地进口环保微生物菌剂达二十万余吨，用于生物防控，随着我国环保意识的增强，进口量将逐年增多，需求量将越来越大，为了增加进口环保微生物菌剂的质量安全，保护我国自然环境不受外来菌种的破坏，需要尽快建立环境污染降解菌剂中短短芽孢杆菌的检验方法。

发明内容

鉴于此，本发明公开提供了一种基于实时荧光PCR检测短短芽孢杆菌的引物和探针、试剂及其试剂盒与方法，以弥补我国在环境污染降解菌剂中短短芽孢杆菌的检测空白。

本发明一方面提供了一种基于实时荧光PCR检测短短芽孢杆菌的引物和探针，所述引物包括上游引物P1以及下游引物P2；

所述上游引物P1具有SEQ No.1序列；

所述下游引物P2具有SEQ No.2序列；

所述探针具有SEQ No.3序列。

优选，所述探针的5'端用报告荧光染料FAM标记，所述探针的3'端用淬灭荧光染料TAMRA标记。

本发明还提供了一种基于实时荧光PCR检测短短芽孢杆菌的试剂，所述试剂中含有上述的引物和探针。

本发明同时还提供了一种基于实时荧光PCR检测短短芽孢杆菌的试剂盒，所述试剂盒中含有上述的引物和探针或含有上述的试剂。

优选，所述试剂盒还含有DNA聚合酶反应液、空白对照品、阳性对照品以及阴性对照品。

本发明另一方面还提供了一种检测短短芽孢杆菌的实时荧光PCR方法，所述方法采用上述引物和探针或上述试剂或上述试剂盒，具体步骤如下：

——提取待测样品基因组DNA；

——以所提取得DNA为模板，加入引物、探针以及DNA聚合酶反应液进行实时荧光PCR反应，其中，反应条件为：94℃15min，循环1次；94℃3s，59℃32s，循环40次，记录样品反应Ct值；

——在样品检测的同时，设置空白对照、阴性对照以及阳性对照，其中，空白对照以ddH20为模板，按照上述条件进行实时荧光PCR反应，检测Ct值大于或等于40；阴性对照以非短短芽孢杆菌物种基因组DNA为模板，按按照上述条件进行实时荧光PCR反应，检测Ct值大于或等于40；阳性对照以短短芽孢杆菌基因组DNA或目的基因质粒片段为模板，按照上述条件进行实时荧光PCR反应，检测Ct值小于或等于35；