[发明专利]一种用于检测KIAA1549-BRAF融合基因的荧光原位杂交探针及其制备方法和应用

说明书

本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种用于检测KIAA1549‑BRAF融合基因的荧光原位杂交探针及其制备方法和应用。所述荧光原位杂交探针包含两个探针库，KIAA1549基因杂交探针库：探针的起始位置设计在KIAA1549基因断裂点左右各200Kb范围内，探针向着丝粒方向延伸，探针的长度为300～1000Kb；BRAF基因杂交探针库：探针的起始位置设计在BRAF基因断裂点左右各200Kb范围内，探针向端粒方向延伸，探针的长度为300～1000Kb。本发明在两个融合基因外区域分别设计探针，实现了在同一条染色体上两个距离比较近的融合基因检测，能够在细胞水平上很直观的反应两个基因的融合状态。

技术领域

本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种用于检测KIAA1549-BRAF融合基因的荧光原位杂交探针及其制备方法和应用。

背景技术

毛细胞星形细胞瘤(PA)是一种WHO分级为Ⅰ级的颅内原发肿瘤，在儿童神经外科中是最为常见的神经胶质瘤，统计其约占脑部肿瘤的25％。KIAA1549基因和BRAF基因均位于7号染色体q34区域，BRAF基因的串联重复导致了KIAA1549/BRAF基因融合，在毛细胞型星形细胞瘤中高发(60％～80％)。根据KIAA1549及BRAF基因互相融合的位置不同，日前已报道5种不同融合变体，分别为：KIAA1549ex16-BRAF ex9，KIAA1549ex15-BRAF ex9，andKIAA1549ex16-BRAF ex11，KIAA1549ex18-BRAF ex10和KIAA1549ex19-BRAF ex9；前三种依次占全部变异数目的45％，28％和5％，后两种相对较少。尽管产生上述融合的内在机制目前仍不十分清楚，但不同类型的KIAA1549-BRAF融合突变被认为具有相同的功能。

目前为止，对于PA发生发展中的分子机制仍未有非常明确的结论，在PA患者的染色体7q34中检测到异常的基因拷贝，全基因组的高通量测序技术显示丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路异常，该通路的异常与KIAA1549基因和BRAF基因互相融合相关。越来越到的文献报道，KIAA1549:BRAF融合基因已被用作毛细胞星形细胞瘤的诊断标志物。此外2015年度“中国中枢神经系统胶质瘤诊断与治疗指南”中推荐KIAA1549:BRAF融合基因检测作为毛细胞星形细胞瘤的诊断标志物。

该融合基因的检测方法目前有4种，全基因组测序(WGS)、转录组测序(RNA-seq)、实时荧光定量PCR(qRT-PCR)和荧光原位杂交(FISH)，由于前两种方法成本高、对样本要求高使其在大多数实验室难以广泛推行；后两种方法也是“中国中枢神经系统胶质瘤诊断与治疗指南”中推荐的检测方法，由于KIAA1549:BRAF基因融合有多种形式，PCR技术检测相对比较困难且无法检测出未报道的融合方式。荧光原位杂交(FISH)技术对于融合基因的检测可以非常直观的反应两种基因的融合状态，对于已报道不同融合类型和未报道的融合方式均可以检出，克服了PCR技术的不足。FISH技术对于KIAA1549:BRAF基因融合的检测应该是首选，但由于两个基因均位于7号染色体q34区域，且染色体位置距离较近，因此常规FISH荧光探针很难检测该融合基因。目前针对该融合基因主要有两种检测探针：BRAF断裂探针和KIAA1549/BRAF融合基因探针。由于已有BRAF断裂探针设计区域分别在BRAF基因断裂区域左右各550Kb范围，当BRAF基因断裂后，信号点之间距离为1.4Mb区域，该距离比较近，无法区分开断裂信号点；而KIAA1549/BRAF融合基因探针设计区域(图2)分别两个基因发生融合区域，断裂融合后在两个信号点中间多出一个融合信号，但三个信号点间距离约为1.0Mb区域，同样无法区分开断裂信号点。因此，目前常规BRAF断裂探针和KIAA1549/BRAF融合基因探针均不能完全区分阳性和阴性样本。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，目的在于提供一种用于检测KIAA1549-BRAF融合基因的荧光原位杂交探针及其制备方法和应用。

为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为：