[发明专利]一种高特异性ABE碱基编辑系统及其在β血红蛋白病中的应用

说明书

本发明提供了一种高效靶向HBG1和HBG2启动子区域的ABE碱基编辑系统，可用于治疗β血红蛋白病，所述系统包括多种特异靶向HBG基因启动子区域的高特异性gRNA，将该系统导入到人的体细胞中，催化靶位点处腺嘌呤(Adenine，A)至鸟嘌呤(Guanine，G)的高效置换，提高HBG1和HBG2的表达水平，从而治疗β血红蛋白病(如β‑地中海贫血、镰刀型细胞贫血症等疾病)。该技术在β血红蛋白病基因治疗领域，具有广泛的应用前景。

技术领域

本发明涉及基因修饰领域，更具体地，涉及一种高特异性ABE碱基编辑系统及其在基因编辑、基因治疗、尤其在β血红蛋白病治疗中的应用。

背景技术

β血红蛋白病是由红细胞血球蛋白合成异常导致的遗传疾病,主要包括β地中海贫血和镰刀型细胞贫血症。成年人的血球蛋白包含Hb A2(2.5％)，Hb F(0.5％)和Hb A1(97％)三种类型。其中占比最大的HbA1蛋白由2个α球蛋白亚基和两个β球蛋白亚基组成。HbF蛋白由2个α球蛋白亚基和两个γ球蛋白亚基组成。由其中β血红蛋白病是由血球蛋白β球蛋白亚基突变导致的一种常见单基因遗传疾病，其编码基因为HBB(human β globin)。γ球蛋白亚基由HBG1和HBG2两个基因编码。临床研究发现，HbF高表达可以缓解β地中海贫血和镰刀型细胞贫血症的症状。故而，提高HbF的表达成为治疗β血红蛋白病的治疗方法之一。前人的研究发现，将位于HBG1和HBG2启动子区域内的GTGTGGGGAAGGGGCCCCCAAG序列中的A(下划线标注)突变成G,可以提高γ球蛋白的表达(Wienert,B.et al.KLF1drives theexpression of fetal hemoglobin in British HPFH.Blood 130,803-807(2017))。

ABE碱基编辑系统是由TadA:TadA*:Cas9融合蛋白和gRNA两部分组分组成的。在gRNA的引导下，

TadA:TadA*:Cas9融合蛋白能够与DNA上的靶位点结合，其中与gRNA互补的DNA链会被Cas9核酸酶切断，而非互补链上4-9位的A碱基则会被腺嘌呤脱氨酶——TadA蛋白——催化脱氨基形成I碱基。随着DNA的复制，I(次黄嘌呤，Inosine)碱基会被G(鸟嘌呤,Guanine)碱基替代，从而实现A至G的碱基置换。

2017年，哈佛大学的David Liu组发现，利用ABE碱基编辑系统结合引导序列为GUGGGGAAGGGGCCCCCAAG的gRNA(命名为HBG-GX19gRNA,SEQ ID NO.6)可以将GTGTGGGGAAGGGGCCCCCAAG序列中的A(下划线标注)突变成G。提取患者自身的造血干细胞(Hematopoietic stem cell,HSC)或骨髓细胞，利用腺嘌呤碱基编辑系统编辑HBG1和HBG2的启动子区，则能在原基因座上精确改变HBG1和HBG2的启动子序列，提高HBG1和HBG2的表达，该方法具有效率高、安全性高等特点。将突变修复了的HSC回输给患者，则能治疗β血红蛋白病人。

但是，我们的研究发现，David Liu组提供的HBG-GX19gRNA(SEQ ID NO.6)和ABE碱基编辑系统有脱靶效应。因此，有必要提供一种具有更高特异性的gRNA和ABE碱基编辑系统来编辑HBG1和HBG2的启动子区域，以上调γ球蛋白的表达，提高HbF的水平，从而治疗β血红蛋白病。

发明内容