[发明专利]一种双控延迟裂解性质粒及其构建方法与应用

说明书

本发明提供一种具有双控延迟裂解的质粒系统及其质粒的构建方法与应用。本发明的双控延迟裂解性质粒含有如SEQ ID NO.1所示的基因序列。本发明还提供了上述质粒的构建方法，将该质粒用于由细菌介导的疫苗递呈或由细菌介导的分子药物治疗方面的应用，初步实现了细菌的双控延迟裂解，可以实现在含有诱导剂(阿拉伯糖)时正常生长；在不含有诱导剂时，细菌在低浓度正常生长，在高浓度时细菌开始裂解。一方面使之对于宿主更加安全，另一方面可以有效的释放细菌介导的疫苗或分子药物等，并取得更好的免疫效果和治疗效果，具有极大的应用前景。

技术领域

本发明属于基因治疗载体技术领域，涉及质粒及其构建与应用，具体涉及一种双控延迟裂解性质粒及其构建方法与应用。

背景技术

质粒是一种遗传因子，是细胞染色体外一种很小的环状DNA分子，其能够进行自主复制，不具有胞外期，其并非是宿主细胞的生长、代谢、繁殖等生命活动所必需，但能赋予宿主细胞某些特殊的属性和功能，如对抗生素的耐受性、对有毒化合物的降解或利用等。现有研究表明，自然界中的许多现象，如微生物对异生体的降解或对重金属的抗性等，以及微生物的功能、特性变化和基因进化等生命现象都往往与质粒有关。

目前对于质粒所进行的研究已经相当普遍和深入，对于质粒的构建方法也有很多种，方法已日渐成熟，目前发现的有著名的降解性质粒如TOL、NAH等，抗性质粒如ColE1、F因子等，研究内容涉及质粒的复制机理，质粒上携带的功能基因的表达、调控等方面。新的质粒的发现与构建仍是目前生命科学的前沿课题与研究热点。

质粒的另一个重要作用是可以作为基因工程的载体，由于质粒能够在适当的宿主细胞中进行自我复制，并在大多数情况下不会对寄主造成损伤，可以很方便地将整合到自身的外源基因引入到目前受体细胞内，因此质粒通常可用作目前基因的克隆和表达载体。

针对于该方面的应用，对于外源基因的表达在实现调控裂解方面进行了一些研究，但是目前调控的手段都较单一，尚无能够很好实现多重调控裂解的方法。

发明内容

本发明的目的就是为了解决上述技术问题，而提供一种具有双控延迟裂解的质粒系统及其质粒的构建方法与应用。该双控延迟裂解性质粒受到两种调控作用，其一是群体感应启动子Pluxi调控，当细菌浓度达到阈值时，细菌发生裂解；其二是受阿拉伯糖(ara)调控，在含有ara环境时，lacI表达并与lacO结合，从而细菌裂解蛋白SRRZ表达受抑制；在不含ara时，LacI不表达，细菌蛋白表达仅受Pluxi控制。将该质粒应用于由细菌介导的疫苗递呈或由细菌介导的分子药物治疗方面，能够实现细菌在体外培养是，加入ara，可以正常生长；在体内没有ara环境下，低浓度时正常生长，在高浓度使细菌开始裂解。初步实现了细菌的双控延迟裂解，在基因治疗方面具有广阔的前景。

本发明的目的之一是提供一种双控延迟裂解性质粒，所述质粒含有如SEQ IDNO.1所示的基因序列。

进一步的是，所述质粒含有araC-Para调控蛋白基因、SRRZ裂解基因、三个lacO操纵序列，群体感应系统启动子Pluxi及相关蛋白LuxI/LuxR的编码基因

进一步的是，上述质粒还含有抗性基因和复制起始位点，如氨苄青霉素抗性基因Ampr和ori起始位点。

本发明的目的之二是提供上述双控延迟裂解性质粒的构建方法，其具体构建步骤如下：

(1)以12pHB质粒为模板进行扩增，在其Pluxi启动子后面加上一个乳糖操纵子的lacO操纵序列，得到5pHB质粒；所述12pHB质粒的序列表如SEQ ID NO.2所示，其是在pUC57质粒中引入一段核心序列；

(2)以5pHB质粒为模板进行扩增，在GFP绿色荧光蛋白后面引入PlacI-LacI序列，得到6pHB质粒；