[发明专利]一种利用CRISPRCas9技术敲除大肠杆菌中多粘菌素耐药基因mcr-1的方法在审
| 申请号： | 201811340748.0 | 申请日： | 2018-11-12 |
| 公开（公告）号： | CN109371048A | 公开（公告）日： | 2019-02-22 |
| 发明（设计）人： | 王红宁;雷昌伟;张安云;孔令汉;陈艳朋 | 申请（专利权）人： | 四川大学 |
| 主分类号： | C12N15/70 | 分类号： | C12N15/70;C12N15/90;C12N15/31;C12R1/19 |
| 代理公司： | 北京众合诚成知识产权代理有限公司 11246 | 代理人： | 苗艳荣 |
| 地址： | 610065 四川省成都市武*** | 国省代码： | 四川;51 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 敲除 大肠杆菌 多粘菌素 耐药基因 退火 电转化法 基因敲除 系统转化 引物序列 重组质粒 构建 双链 质粒 成功率 合成 携带 基因 | ||
1.一种利用CRISPRCas9技术敲除大肠杆菌中多粘菌素耐药基因mcr-1的方法，其特征在于，包括以下步骤：设计如合成sgRNA的两条引物序列SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3，退火形成双链sgRNA序列，与psgRNA-GFP质粒进行连接，构建psgRNA-GFPmcr-1重组质粒，采用电转化法将CRISPR/Cas9敲除系统转化至携带mcr-1的大肠杆菌中，敲除mcr-1基因。
2.根据权利要求1所述的一种利用CRISPRCas9技术敲除大肠杆菌中多粘菌素耐药基因mcr-1的方法，其特征在于，选择PAM区在mcr-1耐药基因第864r位作为靶位点，所述的靶位点的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
3.根据权利要求1所述的一种利用CRISPRCas9技术敲除大肠杆菌中多粘菌素耐药基因mcr-1的方法，其特征在于，所述的退火反应体系为：sgRNA F(100μM)2μl、sgRNAR(100μM)2μl、10×PCR buffer 2μl、ddH2O 14μl；所述的退火条件为：95℃10min，关闭水浴锅，自然降温到25℃。
4.根据权利要求1所述的一种利用CRISPRCas9技术敲除大肠杆菌中多粘菌素耐药基因mcr-1的方法，其特征在于，所述的方法中sgRNA退火产物与酶切回收的psgRNA-GFP质粒连接的反应体系为：退火后的sgRNA 0.5μl、酶切后的psgRNA-GFP质粒1μl、5×T4DNA ligaseBuffer 2μl、T4DNA ligase 1μl；反应条件为：25℃连接反应2h。
5.根据权利要求4所述的一种利用CRISPRCas9技术敲除大肠杆菌中多粘菌素耐药基因mcr-1的方法，其特征在于，所述的sgRNA退火产物与酶切回收的psgRNA-GFP质粒的摩尔比为10:1。
6.根据权利要求5所述的一种利用CRISPRCas9技术敲除大肠杆菌中多粘菌素耐药基因mcr-1的方法，其特征在于，酶切反应体系为：psgRNA-GFP质粒1.7μl、BamHI限制性内切酶1μl、XbaI限制性内切酶1μl、10×NEB buffer 5μl、ddH2O 42.3μl；酶切条件为：37℃水浴2h，酶切完全后65℃20min灭活内切酶。
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