[发明专利]一种重组转氨酶及其在不对称胺化α-羟酮制备手性β-氨基醇中的应用

说明书

本发明属生物技术领域，提供一种重组转氨酶及其在不对称胺化α‑羟酮制备手性β‑氨基醇中的应用,重组转氨酶来源于结核分枝杆菌，重组转氨酶的制备方法为：将编码所述转氨酶的基因插入到质粒中得到重组表达载体；将所述重组表达载体转移到宿主微生物中得到基因工程菌；培养基因工程菌得到重组转氨酶；其中：重组表达载体为pET系列载体；宿主微生物为大肠杆菌E.coli。该酶的基因序列总共包含1020 bp碱基,编码339个氨基酸。对该酶进行重组表达、纯化和表征。应用该酶不对称胺化α‑羟酮生产（S）‑苯甘氨醇产量可达到68.6 g/L/d。转氨酶用于制备手性邻氨基醇的方法简单，高效，具有潜在的工业化应用前景。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种重组转氨酶及其在不对称胺化α-羟酮制备手性β-氨基醇中的应用。该酶能以外消旋邻氨基醇作为氨基供体，丙酮酸作为氨基受体，在PLP存在下，将外消旋邻氨基醇中一个对映体完全转化为羟酮，剩下另一个未反应的对映体。同时，该酶能利用胺化合物作为氨基供体，α-羟酮作为氨基受体，在PLP存在下，将α-羟酮完全转化（S）-β-氨基醇。

背景技术

手性邻氨基醇类化合物广泛存在于天然产物和人工合成化合物中，是一类重要的药物合成中间体。近年来，随着手性化合物的快速发展，手性邻氨基醇类化合物在医药和农业等方面发挥着越来越重要的作用，主要用于不对称合成手性催化剂的配体或作为合成手性化合物中的手性砌块。如S构型的DPMPM在催化二乙基锌和苯甲醛的不对称加成反应中，产物的ee值达到了97%，而DPMPM则是由脯氨醇衍生得来的。同时，手性氨基醇化合物还是很多药物的中间体，如手性-缬氨醇作为选择性有机催化剂用于交叉羟醛缩合反应；（S）-2-氨基-1-丁醇可被用来作为手性配体合成抗结核药乙胺丁醇；(1S,2R)-顺式-1-氨基-2-茚醇作为手性拆分试剂和手性助剂用于合成HIV蛋白酶抑制剂。

手性邻氨基醇的制备方法主要有两种：化学法和生物法。化学法主要有Sharpless胺羟化烯烃，还原氨基酸和氨基酸酯制备手性氨基醇。。化学法反应条件较苛刻，需要昂贵的金属催化剂，产物收率和対映过量体ee值不高，而且容易造成环境的污染。生物法主要利用脂肪酶和转氨酶作为生物催化剂对外消旋氨基醇进行动力学拆分，酮还原酶不对称还原手性氨酮。转氨酶作为一种可靠酶可以被用来合成手性胺和非天然氨基酸，但是用于不对称还原羟酮合成手性邻氨基醇却鲜有报道。转氨酶(Aminotransferases,ATs)是依赖5-磷酸吡哆醛(PLP)的一种酶。转氨酶催化的转氨反应由两步反应组成，第一步反应是转醛亚胺过程，酶活性位点上赖氨酸残基上5-磷酸吡哆醛(PLP)和-NH₂之间的席夫碱被氨基供体和PLP之间的席夫碱所取代形成一个外部的醛亚胺，释放出来的赖氨酸残基成为以后的催化剂，然后是1,3氢转移到从外部醛亚胺去质子化的亚胺，得到酮亚胺中间体，再将酮亚胺中间体水解释放氧化产物和5-磷酸吡哆胺(PMP)。第二步反应包括氨基受体接受氨基生成相应的胺类产品和辅酶再生的过程。转氨酶作为催化剂有着非常高的选择性和转化率，且反应条件温和，对手性邻氨基醇的高效、绿色合成具有潜在的工业化应用价值。

发明内容

本发明提供了一种重组转氨酶及其在不对称胺化α-羟酮制备手性β-氨基醇中的应用,该重组转氨酶能以外消旋邻氨基醇作为氨基供体，丙酮酸作为氨基受体，在PLP存在下，将外消旋邻氨基醇中一个对映体完全转化为羟酮，剩下另一个未反应的对映体。同时，该酶能利用R-苯乙胺、丙氨酸、异丙胺等胺化合物作为氨基供体，α-羟酮作为氨基受体，在PLP存在下，将α-羟酮完全转化（S）-β-氨基醇，因此该重组转氨酶可拆分外消旋邻氨基醇制备（R）-β-邻氨基醇,也可不对称还原氨化α-羟酮制备（S）-β-氨基醇。