[发明专利]一种基于全基因组DNA甲基化位点基因型的分型方法

说明书

本发明提供了一种基于全基因组DNA甲基化位点基因型的分型方法，涉及植物分子育种技术领域，包括提取相同组织样品的基因组DNA；建立重亚硫酸盐处理的DNA文库，再进行测序，根据测序结果鉴定每个样品的DNA甲基化位点，计算甲基化支持率，根据甲基化位点的DNA甲基化支持率进行基因型分型。本发明提供的方法能够实现DNA甲基化位点等位基因型分型，而且本发明提供的分型方法是在相同时间点采取群体内不同个体的同一组织，可以排除环境效应以及生长状态对DNA甲基化状态的影响。本发明提供的方法利用高通量测序技术方法，对DNA甲基化位点的基因型进行精准分型。

技术领域

本发明涉及植物分子育种技术领域，具体涉及一种基于全基因组DNA甲基化位点基因型的分型方法。

背景技术

DNA甲基化(DNA methylation)是最早发现的基因表观修饰类型之一，是一种DNA水平上的化学修饰类型，能在不改变DNA序列的前提下造成基因功能发生可遗传的变化，并最终导致表型变异的遗传学机制。在高等真核生物中，DNA甲基化常发生在DNA的胞嘧啶(C)上，它是在DNA甲基转移酶的作用下，将S腺苷酰甲硫氨酸(SAM)分子上的甲基转移到DNA分子中胞嘧啶残基的5位碳原子上。并且DNA甲基化位点可随DNA的复制而遗传，因为DNA复制后，甲基化酶可将新合成的未甲基化的位点进行甲基化。

全基因组重亚硫酸盐测序(whole genome bisulfite sequencing)是现在研究全基因组DNA甲基化最重要的实验技术。DNA经重亚硫酸盐处理后未甲基化的C碱基转换为U碱基(经PCR扩增后最终为T碱基)，而甲基化的C碱基则保持不变，以此与原本具有甲基化修饰的胞嘧啶区分开来，再对PCR产物进行高通量测序，可绘制单碱基分辨率的全基因组DNA甲基化图谱。

DNA甲基化作为核基因组的共价修饰，可在有丝分裂和减数分裂过程中实现精准地遗传，与DNA序列自然突变产生的SNP相似，由于基因组中DNA甲基转移酶的保真度较低，基因中甲基化位点状态维护过程中会发生错误，导致单甲基化多样性位点的出现。对这些SMPs位点进行基因型分型，可在进一步的对DNA甲基化位点的功能进行深入探究。

目前，基于全基因组重亚硫酸盐测序方法，仅获得了单甲基化多样性位点，而没有合适的方法对DNA甲基化位点的等位基因型进行基因型分型。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于全基因组DNA甲基化位点基因型的分型方法，采用本发明提供的方法，能够对DNA甲基化位点的等位基因型进行分型。

本发明提供了一种基于全基因组DNA甲基化位点基因型的分型方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)分别提取群体中每一个体的相同组织样品的基因组DNA；

2)根据所述步骤1)提取的每个样品的基因组DNA建立重亚硫酸盐处理的DNA文库；

3)分别对每个样品建立的重亚硫酸盐处理的DNA文库进行测序，得到每个样品的测序结果；

4)根据步骤3)每个样品的测序结果鉴定每个样品的DNA甲基化位点；

5)计算每个样品的每个DNA甲基化位点的甲基化支持率，根据甲基化位点的DNA甲基化支持率进行基因型分型；

当DNA甲基化支持率大于0.7时，基因型为M:M；

当DNA甲基化支持率为[0.3～0.7)时，基因型为U:M或M:U；

当DNA甲基化支持率小于0.3时，基因型为U:U。

优选的，所述步骤2)基因组DNA建立重亚硫酸盐处理的DNA文库的方法包括：

将所述基因组DNA随机打断为200～300bp的片段；