[发明专利]一种表达制备UDP-葡萄糖-4-差向异构酶的方法

说明书

本发明涉及一种高效表达制备UDP‑葡萄糖‑4‑差向异构酶的方法，是将UDP‑葡萄糖‑4‑差向异构酶(GalE)基因与枯草芽孢杆菌用载体构建重组表达载体。然后将重组表达载体转化至枯草芽孢杆菌中构建重组工程菌。将重组工程菌在液体培养基中诱导培养，菌液离心，取上清液。本发明的方法UDP‑葡萄糖‑4‑差向异构酶产量高，蛋白较纯净，回收纯化容易，生产操作简单，为GalE的工业化大规模生产提供了便利，提高了产量，省时省力，节约成本。尤其是对该酶在食品工业中的应用提供了安全保障，具有重大意义。

技术领域

本发明涉及一种能高效表达UDP-葡萄糖-4-差向异构酶的重组工程菌以及用改进高效表达制备UDP-葡萄糖-4-差向异构酶的方法，属于基因工程技术领域。

背景技术

UDP-葡萄糖-4-差向异构酶(UDP-glucose 4-epimerase,GalE)，是参与到生物体内半乳糖代谢的一个关键酶，和半乳糖激酶(galactokinase)，1-磷酸半乳糖尿苷酰转移酶(galac-tose-1-p-uridylyltransferase)共同参与到半乳糖代谢，这一过程称为Leloir途径。UDP-葡萄糖4-差向异构酶催化半乳糖代谢是Leloir的最后一步，也是关键的一步，通过UDP-半乳糖和UDP-葡萄糖之间的转化，耦联糖酵解和TCA循环而完成代谢过程。此外，枯草芽孢杆菌被认为是动物肠道内的益生菌，安全性高，可应用于食品、药品等工业中，具有非致病性；外源DNA获取方便，不仅质粒可作为异源基因的克隆载体，噬菌体也可以应用于此，具有较强的遗传特性；蛋白的分泌系统较为完善，分泌的外源蛋白可跨过细胞膜直接释放到细胞外，具有较强的蛋白分泌能力，从而简化蛋白的回收和纯化过程，适用于工业化生产；在较为简单的培养基中培养，就能达到很高的菌密度，适用于工业化生产。然而现有技术中，UDP-葡萄糖4-差向异构酶在野生菌中提取时的产率很低，分离精制困难，不适合大批量的制备。有通过大肠杆菌表达UDP-葡萄糖-4-差向异构酶的，但在大肠杆菌中是胞内表达，易形成包涵体，同时，酶蛋白的获取需要对细胞进行破碎处理，杂蛋白含量高，分离精制困难，操作繁琐耗时，蛋白表达量也不高。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明的目的之一是采用基因工程技术构建一种高效表达UDP-葡萄糖-4-差向异构酶的重组表达载体及重组工程菌。

本发明的目的之二是提供一种产量高，蛋白较纯净，回收纯化容易，生产操作简单的利用重组工程菌生产UDP-葡萄糖-4-差向异构酶的方法。

本发明采用的技术方案是：一种高效表达UDP-葡萄糖-4-差向异构酶的重组表达载体，所述的重组表达载体是将UDP-葡萄糖-4-差向异构酶(GalE)基因与表达载体连接，构建的重组表达载体；所述的表达载体是枯草芽孢杆菌用载体或大肠杆菌-枯草芽孢杆菌用穿梭载体。

进一步的，上述的高效表达UDP-葡萄糖-4-差向异构酶的重组表达载体，所述的表达载体是pHT系列载体、穿梭载体pMA5或穿梭载体pWB980等。但不限于这些载体，所有枯草芽孢杆菌用载体或大肠杆菌-枯草芽孢杆菌用穿梭载体均可使用。

更进一步的，上述的高效表达UDP-葡萄糖-4-差向异构酶的重组表达载体，所述的pHT系列载体是pHT43、pHT304或pHT01载体。

进一步的，上述的高效表达UDP-葡萄糖-4-差向异构酶的重组表达载体，所述的表达载体中含有或不含有蛋白纯化标签。

更进一步的，上述的高效表达UDP-葡萄糖-4-差向异构酶的重组表达载体，所述的蛋白纯化标签是组氨酸(His-tag)标签。

一种高效表达UDP-葡萄糖-4-差向异构酶的重组工程菌，是将上述的高效表达UDP-葡萄糖-4-差向异构酶的重组表达载体转化至宿主菌中构建的重组工程菌；所述的宿主菌是枯草芽孢杆菌。

进一步的，上述的一种高效表达UDP-葡萄糖-4-差向异构酶的重组工程菌，所述的转化为电转化。