[发明专利]一种快速、灵敏和现场检测PML/RARα融合基因的检测方法

说明书

本发明公开了一种基于等温指数扩增介导金纳米粒子聚集的PML/RARα融合基因快速检测方法，在金纳米粒子溶液中加入巯基修饰的固定探针，冰箱过夜后取出封闭，在溶液中加入模板DNA反应5分钟,再加入待测样本、DNA聚合酶与剪切酶进行指数扩增，30分钟后肉眼观察溶液颜色的改变。本发明利用等温核酸指数扩增技术以及金纳米粒子聚集颜色可变的特点，极大提高了PML/RARα融合基因检测的灵敏度以及检查速度，使其可以进行即时现场检验。利用等温核酸指数扩增技术可极大地提高灵敏度，不需特殊仪器以及专业人员，而利用金纳米粒子聚集颜色可变的特点，其检测结果可用肉眼观察，极大地简化了整个检测过程，使其具有广泛的应用前景，特别是边远资源匮乏的地区。

技术领域

本发明涉及一种PML/RARα融合基因的检测方法，尤其涉及一种基于等温指数扩增介导金纳米粒子聚集的PML/RARα融合基因快速检测方法，属于生物医学检测领域。

背景技术

急性早幼粒细胞白血病（acute promyelocytic leukemia, APL）是急性髓系白血病的一种。其主要特征是不成熟的骨髓前体细胞被阻滞在早幼粒细胞阶段并大量增殖，导致骨髓或外周血中异常的早幼粒细胞聚集。该类白血病占急性髓系白血病的15%，临床上表现为血纤维蛋白原减少，易发生严重的出、凝血并发症，预后凶险，常导致患者早期死亡。同时，APL的早期干预是治疗效果最好的一种白血病，并有望痊愈。目前临床上APL的诊断主要是靠骨髓象形态学检查、细胞化学染色以及免疫分型。但这些检查存在耗时、技术与仪器设备要求高、费用昂贵等缺点，限制了它们的推广和应用。所以亟待发展一种方便、快捷、准确的APL早期检查诊断方法。

在细胞遗传学上，超过95% APL患者的15号和17号染色体分别断裂并发生易位t（15; 17）（q22; q21），从而形成PML/RARα融合基因。该融合基因为APL所特有，在其发生发展中起关键作用。2001年开始，WHO规定早幼粒细胞白血病的诊断必须确定有PML/RARα等四种融合基因中的一种存在。因此，检测PML/RARα融合基因能够为早期诊断和筛查APL。

传统PML/RARα融合基因检测方法包括实时定量逆转录聚合酶链反应（real-timequantitative reverse transcription polymerase chain reaction, RT-qPCR），荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization, FISH），流式细胞术（flow cytometry,FCM）和染色体检查等。但是这些方法有许多限制，比如耗时、费用昂贵和操作繁琐等。鉴于以上问题，所以发展快速、灵敏、易于操作的检测方法已成为目前融合基因检测分析的迫切需求。

发明内容

本发明的目的旨在提供一种快速、灵敏和现场检测PML/RARα融合基因的检测方法。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：一种基于等温指数扩增介导金纳米粒子聚集的PML/RARα融合基因快速检测方法，包括以下步骤：

1）将悬浮稳定的金纳米粒子与用 TE 缓冲液配制的巯基标记的捕获探针混合，置于4℃冰箱过夜；

2）将步骤1中的金纳米粒子离心，用TE 缓冲液清洗、分散，用 6- 巯基 -1- 己醇封闭1小时，再次离心、清洗、分散。

3）将步骤2得到核酸修饰的金纳米粒子溶液中加入模板DNA和待测样品，在室温反应5分钟；

4）在步骤3中的溶液中加入含 dNTP、 聚合酶和剪切酶的指数扩增反应液，室温下反应30分钟后肉眼观察结果，根据溶液颜色是否变红作为是否存在白血病融合基因的依据。

所述步骤1中金纳米粒子的直径为150 nm，捕获探针的浓度为100 nM。

所述步骤1中巯基标记的捕获探针序列为：