[发明专利]提高PRSV抗病育种高效性和广谱性的基因及编辑方法

说明书

本发明公开了一种提高PRSV抗病育种高效性和广谱性的基因及编辑方法，基因编辑方法包括以下步骤：(1)根据抗病育种范围，从PRSV的关键基因入手，根据株系地理来源，建立这些基因的基因库；(2)对基因库内的序列进行同源性和聚类分析，获得基因库内病毒株系的同源性、变异性，以及基因序列分类信息；(3)对目标关键基因进行蛋白结构分析，找出活性中心位置；(4)在关键基因活性中心及附近进行基因编辑打靶，依据株系聚类情况选择多个靶点数进行基因编辑，可以更准确的反映不同株系特征，获得更高效和广谱的抗病性。

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种抗番木瓜环斑病毒多种地理 株系基因编辑技术育种的基因与基因编辑方法。

背景技术

RNA病毒也称RNA型病毒。植物病毒，除少数例外，几乎都是RNA病毒。 RNA病毒复制过程中，其错误修复机制的酶的活性很低很低，所以变异很快， 而疫苗是要根据病毒的固定基因或蛋白进行开发制作的，所以RNA病毒疫苗较 难开发。番木瓜是中国和其它世界热带地区最重要的消费和出口热带水果之一， 被世界卫生组织列为最有营养价值的十大水果之首。目前是世界上产量增幅最 大的热带水果，年增长率达4％，已成为第四大热带、亚热带畅销水果。

番木瓜环斑花叶病毒(Papaya ringspot virus，PRSV)，是番木瓜(Caricapapaya) 生产上的最大限制因子，为单链正义RNA病毒，几乎没有错误修复机制的酶， 变异很快，有很多地理株系，使生物技术抗病育种难以获得广谱抗病性。以PRSV 为代表的RNA病毒是番木瓜生产上的最大限制因子，不抗病的品种几乎绝产， 该病毒变异大，不同地区存在不同地理株系，就是同一地区也存在多个株系， 在物理和化学防治措施效果不佳与抗性品种缺乏的情况下，现代生物技术方法 被大量引入PRSV的防治工作。近年来一些新的分子生物技术发展起来，其中 最有效的是RNAi干扰技术和CRISPR为代表的基因编辑技术。RNAi干扰技术 侧重内源基因活性表达的研究，基因编辑技术侧重开展一个或几个基因复杂调控系统的研究。

目前，实际利用的番木瓜抗病毒基因多数是来自病毒本身的基因，如病毒 的外壳蛋白基因、复制酶基因、核酶基因、辅助成分－蛋白酶基因等，其中外 壳蛋白基因和复制酶基因的运用较为成功。转化这些基因或基因片段抗性植株 的抗性主要来自转录后基因沉默，这是RNA介导的抗性(RNA干扰)，双链RNA 分子被认为是最适宜的RNA沉默启动者。RNA介导的抗性类似于免疫，需病 毒RNA序列与靶序列同源,允许部分位点的突变、甚至缺失，并且伴随着dsRNA的产生而产生，这种dsRNA是与沉默基因的正义或反义RNA高度同源 性的，但当转基因序列和病毒基因序列的非同源性高于10％的时候，转基因就 很难赋予植物抗病性，因而特异性更强，为了获得广谱的病毒抗性，通过附加 更多的病毒相关序列扩充转基因结构，才能够使转基因植物获得更为广谱的抗 性。但是利用RNA干扰技术培育抗病植系，现有载体技术能够引入植物的外缘 基因序列有限，不能同时转入大量株系的序列信息，使得转基因抗病株系抗病 范围有限，只对转化的病毒株系或相近株系有抗病或耐病性，序列对差别较大 病毒株系没有效果。