[发明专利]补体C1抑制剂的检测试剂盒制备方法

权利要求书

1.一种补体C1抑制剂的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：包被链霉亲和素的载体、生物素标记的C1-INH反应物、C1-INH标准品、抗人C1-INH抗体偶联的辣根过氧化酶试剂、化学发光底物液A和B以及洗涤液。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述载体为化学发光板。

3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，所述抗人C1-INH抗体选自鼠抗人C1-INH单克隆抗体、兔抗人C1-INH多克隆抗体、羊抗人C1-INH的多克隆抗体、鸡抗人C1-INH多克隆抗体中的一种或多种。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述抗人C1-INH抗体选自鼠抗人C1-INH单克隆抗体。

5.权利要求1-4任一项所述的试剂盒的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

(1)包被链霉亲和素的载体的制备：包被链霉亲和素的96孔化学发光板：将包被用链霉亲和素加至碳酸盐缓冲液中混匀，加入微孔板内，每孔100μL，包被浓度为5～15μg/mL，4℃过夜孵育，用磷酸盐缓冲液洗涤微孔板5遍后，再加入含有牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液，37℃孵育2小时后，弃去孔内液体，37℃干燥2小时，于铝箔袋真空包装，放2-8℃保存。

(2)生物素标记的C1-INH反应物的制备：用0.1mol/L，pH8.0的碳酸氢钠缓冲液或0.5mol/L，pH8.6的硼酸盐缓冲液，对C1-INH反应物充分透析；然后将C1-INH反应物用0.5mol/L，pH8.6的硼酸盐缓冲液稀释到1mg/mL备用；用0.2mL DMSO溶解1mg的NHSB；向1mLC1-INH反应物溶液加入150μl NHSB溶液；在室温下持续搅拌2-4小时；加入9.6μL 1mol/LNH₄Cl，在室温下搅拌10分钟；在4℃，用PBS充分透析，以除去游离的生物素；最后，样品中加入叠氮钠及1.0g/LBSA，将结合产物置4℃，避光保存。

(3)鼠抗人C1-INH抗体偶联的辣根过氧化酶试剂的制备：称取5mg HRP溶解于1ml蒸馏水中，加入1ml新配的0.06M NaIO4溶液，4℃避光孵育30分钟；孵育结束后加入0.6mL的200mM乙二醇，室温孵育30分钟；孵育结束后加入5mg鼠抗人C1-INH抗体，混合均匀后装入透析袋中，于2L的pH9.6碳酸盐缓冲液中透析，4℃搅拌过夜；取出透析液，加入0.5ml的5mg/mlNaBH₄水溶液，混合均匀后，放4℃孵育2小时，加等量甘油保存。

6.权利要求1-4任一项所述的试剂盒的应用，其特征在于，所述应用的具体方法为：

1)在微孔中每孔加入50μL的生物素标记的C1-INH反应物，室温或37℃孵育10min～30min；

2)孵育结束后，洗板3次

3)将浓度分别为0U/mL、0.05U/mL、0.1U/mL、0.2U/mL、0.4U/mL、0.8U/mL、1.6U/mL的C1-INH校准品各100μL依次加入到微孔板中，然后将100μL样品加入微孔中，室温或37℃孵育30min～60min；

4)孵育结束后，洗板5次；

5)加入100μL鼠抗人C1-INH抗体偶联的辣根过氧化酶试剂，室温或37℃孵育15min～30min

6)孵育结束后，洗板5次；

7)加入化学发光底物A液和底物B液各50μL，5min后读数；

8)建立校准品曲线，将样本检测孔化学发光值的对数值代入校准品曲线，计算出样本中的补体C1抑制剂浓度。