[发明专利]几丁质脱乙酰酶和编码基因及应用

说明书

本发明涉及一种几丁质脱乙酰酶和编码基因及其制备和应用。本发明还提供了一种制备该几丁质脱乙酰酶的方法，即利用基因工程的技术方法，将该几丁质脱乙酰酶的基因克隆到大肠杆菌表达载体PET‑22b上，获得可异源表达该酶的大肠杆菌重组菌株，用该菌株异源表达制备的几丁质脱乙酰酶PsCDA，PsCDA能够使几丁四糖(A4)发生特定的脱乙酰化产生乙酰度分别为75％的几丁寡糖(A3D1)和乙酰度为50％的壳寡糖(A2D2)。能作用于虾蟹壳等不同来源的几丁质和几丁寡糖。本发明提供的几丁质脱乙酰酶可广泛应用于食品科学、生物医药、化工材料等方面。

技术领域

本发明涉及青霉菌(美国菌株分类号Penicillium oxalicum 114-2，TaxonomyID:933388)中几丁质脱乙酰酶编码基因及制备与应用专利说明书。本发明还提供了该几丁质脱乙酰酶的重组质粒和重组基因工程菌株。本发明的几丁质脱乙酰酶PsCDA可以广泛应用于食品科学、生物医药、化工材料等方面。

背景技术

几丁质是自然界中仅次于纤维素的第二大可再生自然资源，广泛存在于海洋中。(陈少波,吴根福.科技通报,2004,(03):258-262.)壳聚糖是几丁质的脱乙酰产物，是自然界唯一存在的一种碱性多糖，分子式为(C6H11NO4)n，具有广谱的抑菌性，保水性，可再生性、良好的生物相容性，可降解性，较高的载药性、无毒副作用等特性，通过戊二醛交联法，接枝、乙酰化等多种化学物理改性之后，广泛应用于医药、环保、食品、农业、造纸、化妆品等领域。传统化学法生产壳聚糖的流程如下：挑选干净的虾蟹壳用4％～6％盐酸浸泡除去无机盐，然后用10％氢氧化钠煮沸洗脱蛋白，漂白清洗晒干得到几丁质，用40％～60％的浓氢氧化钠100～180℃保温1-3小时脱去乙酰基清洗烘干即可得到壳聚糖。此法不仅反应条件要求苛刻，而且会有大量的副产物产生，环境污染严重，存在分离困难等技术缺陷。生物酶法生产壳聚糖反应条件温和，无污染，脱乙酰度稳定，在壳聚糖的生产方面提供了一种新的方法。目前人们已经发现几丁质脱乙酰酶可以直接从几丁质上脱去乙酰基生成壳聚糖，该酶广泛存在于真核生物和原核生物中[Zhao Y.Journal of Biotechnology,2008,136:290]。研究表明几丁质脱乙酰酶已经实现了在毕赤酵母或大肠杆菌中异源表达，以获得表达量高，稳定性好，活性高的几丁质脱乙酰酶，并且部分已经应用于生产实践中。

Blair,D.E.等通过对几丁质脱乙酰酶(CDA)家族的多重序列比对显示，CDA家族的序列中含有五个保守序列，这些序列中含有几个保守的天冬氨酸和组氨酸残基，这些保守序列构成了CDA的活性位点。这五个基序被分别命名为基序1(TFDD)、基序2(HSWSHP)、基序3(RPPY)、基序4(DSLDW)、基序5(GSIVLMH)。基序1(TFDD)包括两个天冬氨酸残基；一个天冬氨酸残基与锌或钴相互作用，第二个天冬氨酸残基与底物结合，使反应生成乙酸。基序2(HSWSHP)中含有两个组氨酸，一个丝氨酸或一个苏氨酸，其中组氨酸可以与金属离子结合稳定酶的结构，丝氨酸或苏氨酸可以与组氨酸结合形成氢键。基序3(RPPY)形成了活性位点凹槽的一侧，它可以与结合醋酸、锌、并协调天冬氨酸的催化活性，酪氨酸可以与乙酸形成氢键，当来源于肺炎链球菌的肽聚糖脱乙酰酶中酪氨酸突变为丙氨酸时，该酶就会发生失活。基序4(DSLDW)构成了活性位点沟槽的另一侧，色氨酸是该基序的关键氨基酸。基序5(GSIVLMH)包含来自于疏水口袋的亮氨酸和来自于和产物乙酸结合的组氨酸(Blair D E,Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States ofAmerica,2005,102(43):15429-15434)。

最早发现CDA是Hearaki等在1974年时从接合菌纲(Zygomycota)的鲁氏毛霉属(Mucorrouxii)中发现的，并对该酶的的一些酶学性质进行了研究。在真菌中人们也发现包括毛霉、根霉、青霉、曲霉、以及黄瓜炭疽病(cucumber anthracnose、小麦条锈病菌(Puccinia striformis)等能够产CDA。另外，CDA在杆菌属的Alcaligenessp细菌中也有发现,1998年Srinivasan分离出了这种能够在胞外大量分泌CDA的碱性细菌。