[发明专利]一种基于离子交换技术及多重放大反应的光致电化学传感器的研制及其应用

权利要求书

1.一种基于离子交换技术以及多重循环放大反应的光致电化学传感器，其特征是：通过核酸内切酶辅助的多重循环放大策略，产生大量的含富C(胞嘧啶)的DNA链，然后原位合成银纳米簇，之后通过硝酸溶解产生银离子，与CdTe量子点发生离子交换反应，产生Ag₂Te(无光电信号)，导致光电信号降低，实现了对腺苷的高灵敏检测。

2.一种制备权利要求1所述的基于离子交换和多重循环放大技术光致电化学传感器，其特征方法由下列步骤组成：

步骤一 制备MPA-CdTe QDs

前驱体NaHTe的制备：在高纯氮气保护下将50mg NaBH₄和80mg Te粉放于反应容器中，加入2mL H₂O，磁力搅拌发生反应，可以适当温度的水浴中使反应加快，当溶液颜色变为深紫色时或者无氢气产生时，说明有NaHTe生成，继续通氮气待用。

生成CdTe QDs：将20μL巯基乙酸加入到30mL 1.25mM CdCl₂溶液中，用0.2M NaOH调节溶液pH＝8(以实际测量为准，滴加NaOH后，溶液有澄清变为白色浑浊，继续边搅拌边滴加，直至溶液由浑浊再次变为澄清)。之后溶液通入氮气30min，除去氧气，之后将刚制备的前驱体NaHTe取500μL加入到反应体系中(注意不要将前驱体中未反应的沉淀物加入到反应体系中)，混合溶液在氮气保护下加热至沸腾，回流8h，即可制得MPA-CdTe QDs，然后冷却到室温下盛放于棕色瓶中待用。

步骤二 核酸的预处理

配制pH＝7.4的TE缓冲溶液(10mM EDTA,1.0mM Tris-HCl和12.5mM的MgCl₂)作为DNA的稀释液。

DNA在使用前，首先在12000rpm下离心1min，使DNA收集至管底，然后按照具体要求配制成浓度均为100μM(即10^-4M)溶液，然后将S1、HP1、HP2、Aptamer稀释成10^-6M，于4℃下保存备用。待测腺苷预先配制出其浓度梯度10^-8M、10^-9M、10^-10M、10^-11M、10^-12M、10^-13M、10^-14M、10^-15M，4℃下保存备用。

步骤三 腺苷的循环放大过程

首先将30μL，1.0×10^-6M的腺苷适体与25μL，1.0×10^-6M的S1在37℃条件下结合杂交2h。之后取上述混合液20μL与100μL的不同浓度的腺苷混合均匀，37℃条件下反应2h。由于腺苷与腺苷的适体特异性结合，会将DNA S1释放出来。

取上述含S1的溶液25μL，然后与HP1(1μM，5μL)、HP2(1μM，5μL)和NEB缓冲溶液5μL混合均匀，37℃条件下摇床中反应45min，充分反应后将5μL 2U/μL Nt.AlWI加入到上述反应体系中，37℃条件下摇床中反应2h，最后将反应体系加热到80℃终止反应，持续20min，得到循环产物DNA c。

取200μL MB，用400μL，0.1M PBS(pH＝7.4)清洗三次，然后分散到含0.2M EDC的120μL的PBS溶液中，在摇床中活化30min。活化完成后，取循环产物20μL，其中循环产物链上的氨基与磁珠上的羧基通过脱水反应结合，反应4-6h。然后配置1mM AgNO₃,其中溶剂是柠檬酸钠(20mM，pH＝7)，取5μL配好的AgNO₃与MB-DNA混合均匀，黑暗条件下15min。之后取5μL，1mM的NaBH₄，溶剂是柠檬酸钠(20mM，pH＝7)溶液，滴加到上述溶液中，黑暗条件下反应2h。

将上述溶液进行磁分离，分散在20μL水中。之后将5μL，0.2mM的HNO₃加入体系中黑暗条件下反应10min。取20μL之前制备的CdTe QDs，离心纯化，之后与上述溶液混合，黑暗条件下反应10min，进行光电信号测定。

步骤四 构建传感器

首先将ITO电极分别用稀盐酸、稀乙醇和去离子水，超声处理15min，然后在烘干待用。将电极浸泡在2％的PDDA中，然后自然晾干，之后将上数述反应中CdTe/Ag₂Te的混合溶液滴加在电极上晾干，待测。该方法的检测是在PBS中室温条件下进行的，采用三电极系统：ITO为工作电极，饱和甘汞电极为参比电极，铂丝电极为对电极，施加的电压是-0.15V，激发光是蓝光。