[发明专利]一种基于字符切片技术的含PAM结构gRNA靶向序列筛选方法及应用

说明书

本发明属于基因工程领域，尤其涉及一种基于字符切片技术的含PAM（Protospacer Adjacent Motif）结构gRNA靶向序列筛选方法及应用系统。包括以下步骤：(1)读入目标基因的脱氧核苷酸（DNA）序列文件数据；(2)交互式界面输入需要分析筛选的PAM序列；(3)解读PAM模块将指定PAM基序转换成字符列表；(4)比较子字符串模块将PAM基序转换成字符列表逐一与移动窗口序列给定位置进行比较，并判断逻辑关系。(5)全程搜索模块在给定的DNA序列及其反向互补序列中搜索满足条件的序列并存储到空列表中。(6)文件输出模块将结果以文本或电子表格形式呈现。本发明解决了现有技术无法实现对给定DNA序列中筛选含有任意PAM识别基序的gRNA靶序列的筛选问题，为下一步gRNA靶序列的评估和选择奠定技术基础。

技术领域

本发明属于基因工程领域，尤其涉及一种基于字符切片技术的含PAM（Protospacer Adjacent Motif）结构gRNA靶向序列筛选方法及应用系统。

背景技术

CRISPR（Clustered regularly interspaced short palindromicrepeats）规律成簇间隔短回文重复；Cas9（CRISPR associated nuclease）是CRISPR相关核酸酶，CCRISPR/Cas9是最新出现的一种由RNA指导的，利用Cas9核酸酶对靶向基因进行编辑的技术。

CRISPR/Cas9系统广泛存在于原核生物基因中，是细菌和古细菌为应对病毒和质粒不断攻击而演化来的获得性免疫防御机制。在这些生物体中，来自噬菌体的外源遗传物质获得和整合入CRISPR位点。这些序列特异的片段被转录成短CRISPR的RNA（CRISPR-derivedRNA），crRNA通过碱基配对与tracrRNA（trans-activating RNA）结合形成双链RNA，然后tracrRNA/crRNA复合体指导Cas9蛋白切断双链DNA。

一旦crRNA结合到Cas9，Cas9核酸酶的构象发生改变，产生一条能通道，让DNA更容易结合。Cas9/crRNA复合体能够识别PAM(5'-NGG)位点导致DNA解旋，使crRNA找到PAM位点相邻的DNA互补链。当Cas9结合到PAM位点相邻的，与crRNA互补的DNA序列上，REC叶内部的桥螺旋和靶DNA形成RNA-DNA 异源双链结构。PAM位点的识别包括可使靶DNA双链断裂(DSB)的HNH和RuvC核断裂的激活，导致DNA降解。如果crRNA与靶DNA不互补，Cas9将会释放出来，寻找新的PAM位点。DNA中的线性靶基因组断裂后可以通过非同源末端接合(NHEJ)或者同源介导的修复(HDR)来进行修复，而非同源末端接合(NHEJ)会引起插入或者删除错误，从而达到定点敲除某种基因的目的。

在利用CRISPR/Cas9系统进行基因组编辑的过程中，tracrRNA和crRNA可以融合成为1条RNA（sgRNA）表达同样可以起到靶向剪切的作用。因此现在我们用的CRISPR/Cas9工具只有Cas9核酸酶和gRNA两部分。应用此工具，可以非常方便快捷的进行任意基因的编辑改造，比如基因敲除、敲入、定点突变等。与 ZFN 和 TALEN 技术相比，CRISPR/Cas9 技术具有载体构建简单、基因编辑效率高、成本低等特点，目前广泛应用于基因功能研究和动植物精准分子育种等领域[1-2]。