[发明专利]一种环境雌激素对家蚕发育毒性测试方法

说明书

本发明公开了一种环境雌激素对家蚕发育毒性测试方法，包括以下步骤：首先是采用口腔灌胃注射含有一系列浓度的受试物于饥饿处理2h的5龄期家蚕幼虫；20min后对灌胃的家蚕解剖取组织器官。毒性终点包括家蚕中肠中谷胱甘肽还原酶活性系数、抗超氧阴离子自由基活力。通过染毒组与对照组的毒性终点比较，确定该受试物对家蚕发育的毒性。研究环境雌激素4‑壬基酚对家蚕幼虫期中肠发育的影响，以确定其对家蚕幼虫期发育毒性的剂量－效应关系。采用本发明技术方案，能对环境雌激素壬基酚产生多个生物效应终点，评价家蚕暴露在雌激素环境浓度水平下存在的潜在风险，是一种相对快速、简便、灵敏的检测方法。

技术领域

本发明涉及生物领域，具体涉及一种环境雌激素对家蚕发育毒性测试方法。

背景技术

环境激素是广泛存在于自然界，对无脊椎和脊椎动物表现雌激素效应的人工合成化学物质。壬基酚（Nonylphenol，NP）是已经被证明具有雌激素效应的物质。NP在工、农业生产过程中得到广泛应用，在常温下稳定，不易被降解。近年来，在我国太湖、松花江流域等许多江河湖泊中都检测出NP。在自来水、牛奶、动植物等生物体内也检测出NP。NP可经多种途径进入生物体内，并具有生物蓄积性。NP的永久性质和亲脂性导致其易积聚在动物组织中，在许多动物体内发现它的急性和慢性毒性影响。

低浓度的环境雌激素对动物的危害在短期内很难观察到，往往需要长时间暴露才能显示出严重后果。国内外学者已就NP对陆生动物、水生动物的机体结构及生理生化效应等方面的影响作了较多的研究工作。其中，抗氧化防御系统作为污染物胁迫的生物标志物的研究，正在成为分子生态毒理学、动物毒理学和环境毒理学领域中新的热点。

家蚕是鳞翅目模式昆虫，已经被广泛用于各类研究。家蚕的生理特征能够代表鳞翅目等一大类群生物。家蚕容易获得并易于在实验室内饲养和繁殖，进行遗传学分析及多种实验操作也更方便。在个体大小方面家蚕具有比果蝇更好的可操作性，还具有比线虫更加复杂的遗传和发育调控机制。具备了环境毒理学实验动物必须的基础。实验室条件下裔洪根等（2008）用家蚕全龄期添食4-壬基酚（4-NP），调查发现4-NP对家蚕的生殖细胞数量、生殖细胞的生长和发育、雌蛾造卵数和产出卵数有一定的关联性。袁红霞等（2013）调查发现4-NP对家蚕的生长发育毒性与家蚕幼虫的生长速度、生长量、发育整齐度、生命力等变化有一定的关联性。综合相关文献，4-NP对家蚕的毒性实验中，都是采用家蚕全龄期添食4-NP的方法，持续25-30天左右。这种全龄期添食4-NP染毒方法，耗时较长，对家蚕的饲养操作有一定的困难。因此，快速鉴别4-NP对家蚕的发育毒性是一项迫切需要解决的技术。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术存在的问题，提供一种环境雌激素对家蚕发育毒性测试方法。为了实现上述目的，本发明提供以下技术方案：

为实现上述技术目的，达到上述技术效果，本发明通过以下技术方案实现：

一种环境雌激素对家蚕发育毒性测试方法，包括以下步骤：

（1）配制壬基酚母液，并将其置于4℃冰箱避光保存备用；

（2）将壬基酚母液用稀释液稀释成三组不同的浓度：0.02、0.20、2.0 g/L，置于4℃冰箱避光保存；

（3）将实验分为四组，包括步骤（2）所述的三种壬基酚浓度的染毒组和空白对照组，每组又设制3个重复组，每组设制15头家蚕，将家蚕饥饿处理2h后，用100 μL平头微量注射器吸取每组溶剂，针头探入蚕口腔注射给药100 μL；20 min后，在超净工作台上进行处理，解剖取中肠，中肠置于冰冷的生理盐水中清洗后装EP管，-20℃保存；

（4）将步骤（3）已取好的中肠组织块制备中肠组织匀浆；

（5）将步骤（4）制得的中肠组织匀浆4℃离心，取上清液后分别测定谷胱甘肽还原酶活性系数（GRAC）以及抗超氧阴离子活力；