[发明专利]嵌合抗原受体DAP12-T2A-CD8α-CD19scfv-NKp44及其用途

说明书

本发明公开了一种优化的嵌合抗原受体DAP12‑T2A‑CD8α‑CD19scFv‑NKp44及其用途，所述的嵌合抗原受体由胞内第二传导结构域DAP12、T2A、CD8α信号肽、抗人CD19单克隆抗体FMC63轻链和重链可变区CD19scFv、胞内第一传导结构域串联构成。该嵌合抗原受体用于修饰T淋巴细胞，修饰后的T细胞(CAR‑T细胞)能用于CD19阳性的恶性血液肿瘤的治疗。在恶性血液肿瘤杀伤试验中，明显加强了CAR‑T细胞对白血病肿瘤细胞的杀伤能力，在临床应用中展现出良好的安全性和抗肿瘤活性。

技术领域

本发明涉及肿瘤免疫治疗技术领域。本发明利用基因工程技术获得编码嵌合抗原受体 DAP12-T2A-CD8α-CD19scFv-NKp44的融合基因，将该基因片段插入慢病毒表达载体，包装成慢病毒，转导入人T淋巴细胞中，使T细胞表达该嵌合抗原受体。本发明还涉及编码此类跨膜多肽的核酸、载体，以及用于免疫治疗的在其表面表达所述CAR的免疫细胞。本发明所涉及的嵌合抗原受体修饰的T细胞能靶向并特异性杀伤CD19阳性的肿瘤细胞，用于恶性血液肿瘤的治疗，开辟了对用于治疗癌症的有效的过继性免疫治疗策略的道路。

背景技术

随着肿瘤免疫学理论和临床技术的发展，嵌合抗原受体T细胞疗法(Chimericantigen receptor T-cell immunotherapy，CAR-T)成为目前最有发展前景的肿瘤免疫疗法之一 [Schmitz M，et al.Chimeric antigen receptor-engineered T cellsforimmunotherapy of Cancer.J Biomed Biotechnol，2010，doi：10.1155/2010/956304.]。嵌合抗原受体(CAR)是CAR-T 的核心部件，CAR能针对所选择的免疫细胞重定向其特异性和反应性，因此赋予T细胞 HLA非依赖的方式识别肿瘤抗原的能力，这使得经过CAR改造的T细胞相较与正常T 细胞受体(TCR)应答不同，不受MHC限制，具有活化和增殖的能力，因此具有高效的杀伤肿瘤细胞的能力。

嵌合抗原受体(CAR)在T细胞上表达合成蛋白，其将抗体的抗原识别片段(如抗体单链可变区片段)与胞内信号结构域融合。研究发现，以肿瘤特异性单克隆抗体的单链可变区(scFv)取代TCR的α，β链可变区，并将scFv直接和T细胞信号传导结构域连接，形成嵌合抗原受体(CAR)表达于T细胞表面，可通过scFv识别肿瘤特异性抗原，直接产生T细胞的活化信号，促进T细胞活化、增殖，特异性杀伤肿瘤细胞。该过程主要依赖CAR-T细胞表面的scFv对肿瘤抗原的特异性识别，免疫反应的特异性和杀伤性较强。

B细胞恶性肿瘤在恶性血液肿瘤中的发病率逐年上升，但B细胞恶性血液肿瘤的治疗手段仍然较局限，目前以化疗、干细胞移植及生物治疗等为主，临床上常用的治疗方案虽然可以有很高的完全缓解率(CR)，但此类疾病易复发及后续治疗耐药性，导致长期预后较差。基于此，肿瘤的细胞免疫治疗作为一种新的治疗策略，成为当今研究的热点。CD19几乎表达于所有的B细胞恶性肿瘤细胞表面，而其他实质细胞和造血干细胞几乎不表达，因此作为B细胞肿瘤抗原的特异性高。利用抗CD19scFv构建的嵌合抗原受体 DAP12-T2A-CD8α-CD19scFv-NKp44表达于T淋巴细胞上，可使T细胞特异性杀伤CD19 阳性的肿瘤细胞，国外已经有两款CD19CAR-T获得FDA批准上市，并且在B细胞肿瘤中的应用取得显著的疗效。

本发明提供一种嵌合抗原受体DAP12-T2A-CD8α-CD19scFv-NKp44，包含胞内第二传导结构域DAP12、T2A、CD8α信号肽、抗人CD19单克隆抗体FMC63轻链和重链可变区CD19scFv、胞内第一传导结构域NKp44。该嵌合抗原受体用于修饰T淋巴细胞，修饰后的T细胞(CAR-T细胞)能用于CD19阳性的恶性血液肿瘤的治疗。在血液肿瘤杀伤试验中，明显加强了CAR-T细胞对肿瘤细胞的杀伤能力，在临床应用中展现出良好的安全性和抗肿瘤活性。

发明内容