[发明专利]一种用于肝脏类器官培养的全小分子培养基及其用途

说明书

本发明公开了一种用于肝脏类器官培养的全小分子培养基及其用途，所述培养基包含基础培养基和小分子的组合，所维持的小分子的组合为CBF。其中C为CHIR‑99021,B为Blebbistatin，C为Forskolin。本发明在基础培养基中添加小分子CHIR，Blebbistatin，Forskolin，从而取代添加生长因子，在体外能够长期培养肝脏胆管的类器官，并可进一步诱导分化形成肝实质细胞。本方法有利于肝脏类器官在体外的大量扩增，并为肝脏相关疾病的研究及治疗提供基础。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地，本发明涉及一种用于肝脏类器官培养的全小分子培养基，更具体地，本发明涉及培养基、CHIR-99021、blebbistatin 以及 forskolin在制备培养基中的用途、培养肝脏类器官的方法。

背景技术

肝脏是机体的重要代谢器官，肝脏受损后会快速启动修复再生，而它的修复再生主要是由肝脏胆管细胞驱动的。近几年肝脏胆管的体外培养系统的推动了对肝脏领域的研究，在体外直接对肝脏胆管进行有效的实验和观察。体外培养的肝脏类器官可移植至受损肝脏并修复受损肝脏，除此之外体外培养的肝脏类器官还用于对病人个体的个性化药物筛选，肝脏的类器官培养在药物筛选和再生医学领域有巨大的应用价值。

在进行小鼠肝脏类器官培养时，使用的培养条件为：基础培养基Advanced DMEM/F12、血清替代物N2和B27、双抗、2mM的GlutaMAX、1mM的N-acetylcysteine和10mM的Nicotinamide,以及培养所需的生长因子：50ng/mL的EGF、25ng/mL的Noggin、500ng/mL的R-spondin 1、100ng/mL的FGF10、50ng/mL的HGF以及10nM的[Leu15]-Gastrin I。进行人的肝脏类器官养时需要在小鼠肝脏类器官培养基的基础上加入10uM 的forskolin，5uM的A83-01。

目前肝脏类器官培养需要加入EGF、Noggin、R-spondin、FGF10、HGF和[Leu15]-Gastrin I等生长因子，这些生长因子价格昂贵，不利于肝脏类器官培养系统的应用，极大的限制的肝脏类器官在体外的大量扩增，用于肝脏医学领域的治疗。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于肝脏类器官培养的全小分子培养基及其用途。

本发明提出的一种用于肝脏类器官培养的全小分子培养基，包括：基础培养基、血清替代物、双抗、谷氨酸盐/酯、N-乙酰半胱氨酸、Nicotinamide、CHIR-99021、blebbistatin和forskolin，其中：所述CHIR-99021的浓度为3μM，所述Blebbistatin的浓度为10μM，所述forskolin的浓度为10μM。

本发明中，所述全小分子培养基还包括SUN11602、FH1和A83-01。

本发明中，所述基础培养基为Advanced DMEM/F12，所述血清替代物为N2或B27中一种或两种，所述双抗为青霉素或链霉素中任一种或两种，所述谷氨酸盐/酯的浓度为2mM，所述N-乙酰半胱氨酸的浓度为1mM，所述Nicotinamide的浓度为10mM。

本发明中，所述SUN11602的浓度为10μM，所述FH1的浓度为10μM，所述A83-01的浓度为0.5μM。

本发明提出的一种的用于肝脏类器官培养的全小分子培养基的用途，所述全小分子培养基用于下列的至少之一：

（１）培养肝脏类器官，其中：所述肝脏类器官为肝脏胆管细胞；

（２）促进肝脏类器官增殖和/或分化，其中：所述小鼠肠隐窝或人肠肝脏胆管中任一种。

本发明中，将包裹在基质胶中的肠隐窝在权利要求１-４任一项所述全小分子培养基中进行培养，所述肝脏类器官为肝脏胆管细胞。