[发明专利]一种建兰茎腐病菌LAMP检测引物组及其快速检测方法

说明书

本发明提供了一种建兰茎腐病菌LAMP检测引物组及其快速检测方法。用于检测建兰茎腐病菌的LAMP引物组由1对外侧引物F3/B3和1对内侧引物FIP/BIP组成，F3/B3和FIP/BIP引物序列如SEQ ID.1‑4所示。包括以下步骤：1）提取待测样品DNA；2）进行LAMP扩增；3）使用荧光染料SYBR Green I对扩增结果进行显色或琼脂糖凝胶电泳对扩增产物进行检测。本发明能快速、方便、高效、高特异、高灵敏地检测到建兰茎腐病菌，不需要复杂昂贵的仪器，能较好地满足对建兰茎腐病菌的现场快速检测，可广泛应用于基层单位田间病害的早期诊断和病菌的监测、鉴定，为防治建兰茎腐病提供可靠的技术和理论依据。

技术领域

本发明属于园艺作物病害检测、鉴定及防治技术领域，具体涉及一种建兰茎腐病菌LAMP检测引物组及其快速检测方法，可用于建兰茎腐病菌快速、灵敏和特异的分子检测，以及建兰茎腐病的早期诊断和病菌的监测和鉴定。

背景技术

茎腐病是建兰生产上最严重的一种世界性土传病害，有“兰花癌症”和“兰花杀手”之称，其致病菌为尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）。自2010年马来西亚槟城首次报道之后，世界各地的兰花种植区普遍发生。该病是一种由土壤传染，从根或根茎部或伤口侵入，在维管束内寄生的系统性病害，是建兰生产上较难防治的病害之一，该病由于具有发病快、病害重、传播迅速等特点，一旦发生常造成经济巨大损失。此病的初侵染源主要是带病菌的土壤、病株残体、种子和粪肥等，病菌从腐烂的寄主组织里散布到土中可营腐生活，存活时间长达5～6年或更长的时间。茎腐病菌可借助雨水、灌溉水等进行远距离传播，整个生长期均能发生。随着农业结构的调整和设施栽培技术的不断发展，建兰种植的面积也越来越大，近年来茎腐病有进一步加重的趋势，一般可导致产量减少20%～40%，甚至全株枯死，导致绝收，严重影响产量和品质。由于茎腐病是一种土传病害，防治上主要以预防为主，防治是否及时，直接影响了对土传病害的防治效果。因此生产上迫切需要建立一种快速、准确的检测建兰茎腐病的方法，为病害的早期诊断与防治、监测、预测预报提供支持和服务，对发展建兰甚至兰花生产、增加花农收入、减少环境污染和维持农业可持续发展，都具有重大的生产意义。

当前，病原菌的检测方法较多，传统真菌菌种鉴定方法主要以形态学为依据，将菌种鉴定到纲、目、科、属、种。真菌的形态特征复杂，且有些菌类形态特征和生理生化特征随着环境的变化而不稳定，因此，在传统的真菌分类中常引起分类系统的不一致。同时传统分类鉴定方法耗时长、灵敏度低、易受人为及环境等诸多因素的干扰，不能直观的在病害潜伏期和初发期做出诊断，很难对病害发生进行及时的监测和有效控制。

随着生物化学、遗传学以及分子生物学的发展，为病原菌的分类鉴定提供了技术条件。如血清学免疫学技术、常规PCR、巢式PCR和实时荧光定量PCR等技术为病原菌的分类鉴定提供了灵敏度高、快速的检测技术。但这些分子生物学技术在一定程度上也存在了一些不足之处，如血清免疫学检测技术在血清的制备过程耗时耗力，常常受到抗血清质量的影响，且可能存在交叉反应，特异性较差，容易造成假阳性，PCR快速检测技术主要包括常规PCR、巢式PCR（Nest-PCR）和实时荧光定量PCR 等，PCR技术检测时间较长，需要依赖贵重、精密的PCR仪、凝胶成像系统等贵重仪器设备及相应的高新技术人员，因而提高了检测成本，并限制了其应用范围，不利于基层生产上推广应用，限制了这些先进方法的推广应用。