[发明专利]一种热稳定型阿拉伯呋喃糖苷酶及其应用

说明书

本发明属于基因工程技术领域，本发明涉及一种热稳定型阿拉伯呋喃糖苷酶及其应用；本发明涉及的阿拉伯呋喃糖苷酶Abf51最适反应条件为60℃ pH6.5，可高效地水解C2与C3位置的单取代阿拉伯糖残基，同时也对双取代阿拉伯糖残基表现出一定的水解能力；Abf51对阿拉伯木寡糖侧链阿拉伯糖残基的水解度可达97%以上；Abf51热稳定性强，在最适反应温度下；保温2天残余活力仍高达90%，保温6天残余活力仍可达68%；Abf51对产物阿拉伯糖也表现出相当的耐受性，IC₅₀大约为200mM；这些优良特性表明Abf51作为一种新型的酶制剂具有良好的应用潜力与价值。

技术领域

本发明涉及一种热稳定型阿拉伯呋喃糖苷酶及其应用，属于基因工程技术领域。

背景技术

半纤维素是植物细胞壁的主要成份之一，而木聚糖是半纤维素中的代表性组份。木聚糖是由D-吡喃型木糖残基以β-1,4糖苷键连接而成，其侧链上还连接有阿拉伯糖、葡萄糖醛酸等取代基。这些侧链的水解与否对于木聚糖主链的降解度具有极大影响，对于阿拉伯木寡糖的生物活性至关重要。因此，阿拉伯呋喃糖苷酶常作为饲料添加剂用以促进反刍动物对半纤维素的消化吸收，也是工业上木质纤维素糖化酶系的必要组份。

阿拉伯呋喃糖苷酶能水解α-L-阿拉伯糖苷中的末端非还原性α-L-阿拉伯呋喃糖苷残基，并分类为EC3.2.1.55。在植物阿拉伯木聚糖中，阿拉伯呋喃糖苷残基连接在木糖残基上的C2或C3位置（单取代），或两者都有连接（双取代）。已知从多种生物体，包括细菌、真菌中分离或异源表达了阿拉伯呋喃糖苷酶。然而很多阿拉伯呋喃糖苷酶存在热稳定性差或者只能水解一种取代类型的糖苷键的缺陷。

发明内容

本发明旨在至少在一定程度上解决相关现有技术中存在的问题之一。为此，本发明提出一种热稳定型阿拉伯呋喃糖苷酶及其应用。

本发明的一个方面，提供一种热稳定性强的阿拉伯呋喃糖苷酶Abf51，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，该酶包括493个氨基酸，N端无信号肽，理论分子量为56kDa。

本发明还提供了编码上述阿拉伯呋喃糖苷酶的基因abf51，基因全长1482bp，该基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明从高温纤维素降解菌Clostridium clariflavum DSM19732基因组中重组异源表达了一种高活性的并热稳定性强的阿拉伯呋喃糖苷酶Abf51。它不仅对木糖残基上的C2或C3位置单取代的阿拉伯糖残基均有较高的水解活力，而且对C2与C3位置的双取代残基也表现出一定的水解活力。本发明的阿拉伯呋喃糖苷酶的最适pH 6.5，最适温度60℃。Abf51具有很高的催化活力：对3²-α-L-阿糖呋喃-木二糖（3²-α-L-Arabinofuranosyl-xylobiose，A³X）及对硝基苯基-α-L-阿拉伯呋喃糖苷(p-Nitrophenyl-α-L-Arabinofuranoside，pNPAF)两种底物的V_max分别高达783.1与664.6 U/mg。在最适条件下，Abf51对2³-α-L-阿糖呋喃-木三糖（2³-α-L-Arabinofuranosyl-xylotriose，A²XX）或3²-α-L-阿糖呋喃-木二糖（3²-α-L-Arabinofuranosyl-xylobiose，A³X）侧链阿拉伯糖残基的水解度分别可达97%以上。同时Abf51也具有出色的耐热性：在其最适温度（60℃）下保温2天，本发明的阿拉伯呋喃糖苷酶的残余活力仍高达90%；保温6天，残余活力仍可达68%。本发明的阿拉伯呋喃糖苷酶对产物阿拉伯糖也表现出一定的耐受性，相应的IC₅₀约为200mM。这些优良特性表明其具有相当的工业应用潜力。